دکتر رضا عطاران
12-24-2011, 11:00 AM
تشخيص ميكروسپوراي پبرين
نمونه گيري بيماري هاي تك ياخته اي كرم ابريشم در كنار يخ و به وسيله دامپزشك ياكاردان دامپزشكي انجام مي شود
به منظور تشخيص مستقيم پبرين ، مي توان از دو روش زير استفاده نمود :
1- تهيه لام مرطوب : از جدار روده لارو بيمار ، مستقيما برداشت شده و به آن يك قطره آب يا پتاس اضافه مي نماييم ، پس از قرار دادن يك لامل بر روي آن و با روغن ايمرسون و عدسي 100 ، مشاهده صورت مي گيرد.
2-رنگ آميزي
الف: رنگ آميزي گيمسا: اين رنگ آميزي بيشتر براي تشخيص اسپور پبرين كاربرد دارد و لي مي تواند به منظور تفريق با فارچ ها، پلي هدراي ويروس هسته اي و سيتوپلاسمي نيز بكار رود.
مواد:
محلول گيمساي غليظ: مواد : پودر گيمسا 1 گرم گليسرول 54 ميلي ليتر
متيل الكل 84 ميلي ليتر
روش توليد پودر گيمسا:
پودر گيمسا را به گليسرول افزوده و به ميزان 60-56 درجه سانتيگراد بمدت 1 ساعت ضمن تكان دادن و هم زدن، حرارت مي دهيم. سپس متيل الكل را افزوده و هم مي زنيم و بمدت 4-2ساعت در درجه حرارت اتاق مي گذاريم بماند .بعد از گذشت اين مدت ، بوسيله فيلتر كاغذي آن را فيلتر نموده و محلول فيلتره شده ، محلول غليظ گيمسا است و مي توانيم در شيشه كوچك رنگي در حرارت اتاق نگهداري كنيم.
روش هاي رنگ آميزي با گيمسا:*
ابتدا مقداري از نمونه را در محلول KOH حل كرده سپس 2-1 قطره از محلول را بر روي لام گسترش داده و در حرارت معمولي آزمايشگاه خشك مي كنيم.
سپس آن را در محلول گيمساي رقيق شده (1 قسمت گيمسا غليظ + 2 قسمت آب مقطر) قرار مي دهيم و براي 2-1 دقيقه روي شعله مي گيريم .
در روشي ديگر مي توانيم گسترش را در محلول گيمساي رقيق شده بطور افقي ، به مدت چهل وپنج دقيقه قرار دهيم . يا اينكه مي توانيم يك قطره گيمساي غليظ را به مدت 5 دقيقه روي گسترش قرار داده و 30 ثانيه به آرامي حرارت دهيم .سپس با*آب آن را شستشو داده و خشك مي كنيم و با روغن ايمرسون و عدسي 100 ميكروسكوپ مشاهده مي نماييم.
نتايج:
اسپور پبرين بعضاً رنگ مي گيرد.
پلي هدراي ويروس هسته اي: رنگ نمي گيرد.
پلي هدرا ي ويروس سيتوپلاسمي : رنگ مي گيرد.
موسكاردين سبز: تماماً رنگ مي گيرد.
ب: رنگ آميزي سبز مالاشيت
مواد:
سبز مالاشيت مايع 5% مركوروكرم 5% سافرانين 25/0%
روش:
1- تهيه گسترش از نمونه و تثبيت آن بوسيله حرارت
2- قرار دادن لام در مايع سبز مالاشيت بمدت 10 دقيقه
3- تجديد مرتب مايع سبز مالاشيت
4- شستن لام بوسيله آب
5- قرار دادن لام درون ظرف محتوي مركوروكرم يا سافرانين بمدت 15 ثانيه
6- شستن لام بوسيله آب و خشك كردن
نتيجه : بوسيله ميكروسكوپ ، با روغن ايمرسون و عدسي 100 اگر نمونه مثبت باشد ،اسپوربه رنگ قرمزدر زمينه سبز مشاهده مي شود .
آزمايشات تكميلي تشخيص پبرين
اگر تشخيص مستقيم پبرين كه با تهيه لام مرطوب وبرداشت مستقيم از روده لارو بيمار با لامل يا رنگ آميزي گسترش مستقيم از روده لارو بيمار با گيمساي رقيق، صورت مي گيرد مثبت باشد،يعني اسپور تخم مرغي مشاهده شود، مي توان با آزمايش هاي زير به تشخيص قطعي رسيد.
الف: روش خروج تاژك قطبي
مواد: محلولH2O2
محلول مولار 25/0 KCL
روش:
1- تهيه گسترش بر روي لام
2- خشك كردن در هواي محيط
3- افزودن يك قطره از محلول هاي H2O2و KCL
4- گذاشتن لامل
5- خشك كردن لام در 30 درجه سانتيگراد براي 40 دقيقه
6- مشاهده باعدسي 40 ميكرسكوپ
نتيجه:
اگر يك فيلامان يا تاژك قطبي از اسپور خارج شده باشد اين اسپور، پبرين است.
ب: روش اسيد:
مواد: محلول اسيد HCL 37% (غليظ)
روش:
1- تهيه گسترش از جدار روده لارو بيمار
2- خشك كردن در هواي معمولي اتاق
3- افزودن يك قطره اسيد و گذاشتن لامل
4- مشاهده باعدسي 40 ميكرسكوپ
در اين روش همه اسپورهاي ناشناخته به استثناء پبرين بوسيله اسيد از بين مي رود.
ج: روش حرارت:
مواد: KOH 20%
روش:
1- تهيه گسترش
2- نگهداري لام در درجه حرارت 130-110 درجه سانتيگراد بمدت 5-3 ساعت
3- مشاهده اسپور با عدسي 40 ميكروسكوپ
4- افزودن محلول KOH %20 بمدت 30-20 دقيقه
5- مشاهده مجدد اسپور
نتيجه:
شكل پبرين در حرارت اوليه تغيير مي كند سپس با محلول KOH مجدداٌ بحالت و شكل اصلي خود برمي گردد.
د: *روش رنگ آميزي
محلول سافرانين سافرانين 25 0 /0گرم
اتيل الكل 99% 10 ميلي ليتر آب مقطر 100 ميلي ليتر
روش:*
1- تهيه گسترش
2- خشك كردن لام بحالت افقي
3- افزودن يك قطره رنگ سافرانين به مدت 5 دقيقه
4- حرارت دادن آرام لام براي 30 ثانيه
5- شستن با* آب معمولي و گذاشتن لامل
6- مشاهده با روغن ايمرسون و عدسي 100 ميكرسكوپ
نتيجه:
در رنگ آميزي با سافرانين هسته اسپورپبرين قرمز تيره و پروتوپلاسم برنگ قرمز روشن در مي آيد.
تشخيص ويروس پلي هدرا ي هسته اي
نمونه گيري بيماري ها ي ويروسي در كنار يخ و به وسيله دامپزشك ياكارذان دامپزشكي انجام مي شود.
1- تشخيص مستقيم : به منظور مشاهده مستقيم پلي هدرا ي چند وجهي ، يك قطره از لنف لارو مشكوك به بيماري را ، بر روي لام گذاشته و لامل را روي آن قرار مي دهيم و با عدسي 40 ميكروسكوپ مشاهده مي نماييم .
نتيجه :
اگر نمونه مثبت باشد، پلي هدرا ي چند وجهي، بي رنگ و براق، بحالت شناور ، مشاهده مي شود.
2- رنگ آميزي
الف : رنگ آميزي بلودو متيلن
مواد: پودر بلودو متيلن 5/2 گرم الكل اتيليك 95 % 100 ميلي ليتر
روش :يك قطره از لنف را ، روي لام گذاشته و با حرارت آن را تثبيت مي كنيم و سپس رنگ را به مدت يك دقيقه روي لام مي دهيم.
نتيجه:
در اين رنگ آميزي، مشاهده لام با عدسي 100 و روغن ايمرسون صورت مي گيردو زمينه لام آبي رنگ و پلي هدرا ي چند وجهي هسته اي رنگ نگرفته مشاهده مي شود و پلي هدراي سيتوپلاسمي رنگ آبي را به خود مي گيرد .
تشخيص بيماري هاي قارچي
نمونه گيريبيماري هاي قارچي در كنار يخ و به وسيله دامپزشك يا كاردان دامپزشكي انجام مي شود.
الف: گسترش مستقيم : مي توان گسترش مستقيم را از سطح پوست بدن كرم ابريشم ، با يك قطره آب يا يك قطره پتاس تهيه نمودو با عدسي 40 مشاهده كرد.
ب: رنگ آميزي(Lactophenol-cotton blue)
مواد:
فنل، ذوب شده ( بااحتياط) 20 گرم اسيد لاكتيك 20 ميلي ليتر
گليسيرين 40 ميلي ليتر آب مقطر 20 ميلي ليتر
cotton blue(methyl blue) % 0/05
روش: آب گرم را به فنل ذوب شده افزوده و اسيد لاكتيك و گليسيرين را بآن اضافه مي كنيم سپس رنگبي متيل5/0% را به لاكتوفنل مي افزاييم.
نتيجه:
1 -موسكاردين :
در گسترش مرطوب از ميسليوم ها كه مختصري حالت پودري و كرك مانند دارند، مي توان كونيدياي منفرد را ، در گروه هاي نامنظم يا خوشه اي سربالا ديد. در بعضي انواع، قسمت هاي پايه، قطور اما در انتها نوك تيز مي شود، كه بعد از چندين تقسيم بحالت زيگزاكي قرار مي گيرند. به عبارت ديگركونيديا داراي شاخه هاي منشعب با محورهاي جداگانه وگرد است كه كمتر تك سلولي بوده ودر انتها دندانه هاي كوچك منفردي را ايجاد مي نمايند و انگل حشرات نيز هستند.
2- آسپرژيلوس: در گسترش مرطوب كونيديوفور عمودي و مسقيم، ساده و در انتها گرد و برآمده،يا بعبارتي چماقي شكل است كه داراي شعاع هايي در بالاي سر يا در تمام سطح مي باشد و كونيديا شعاعي با محورهاي جدا گانه است.
د:كشت قارچ
از محيط سابور دكستروز آگار به منظور كشتقارچي براي قارچ هاي بيماريزا ي موسكاردين و آسپرژيلوس استفاده مي شود. پس از رشد قارچ با تهيه لام مرطوب آن را مشاهده مي نماييم .
تشخيص باكتريايي
نمونه گيري بيماري هاي باكتريايي در كنار يخ و به وسيله دامپزشك يا كاردان دامپزشكي انجام مي شود.
1- استرپتوكوك Streptococci. Sp
همه انواع استرپتو كوك ميتواننددر بيماريزائي كرم ابريشم نقش داشته باشند. در سپتي سمي ،آلودگي بيشتر از طريق ضربه*ها و زخم ها و بندرت از طريق دهاني صورت مي*گيرد. در بيماري هاي گوارش كرم ابريشم آلودگي بيشتر از طريق دهاني صورت مي*گيرد.
براي جداسازي انواع استرپتو كوك ، بهترين محيط Blood. Agar است .كه در اين محيط اگر نمونه استرپتو كوك مثبت باشد، مي توان هموليز ß يا* a را در آن مشاهده كرد و با گرفتن گسترش و رنگ آميزي گرم و ديدن باكتري گرم مثبت كروي به قطر8/0- 6/0ميكرون كه بشكل دانه ها ي تسبيح بدنبال هم قرارگرفته اند، تشخيص قطعي است.
اين باكتري ، كاتالاز منفي است وآزمايش كاتالاز آن را از استافيلوكوك تفريق مي كند. در صورت لزوم از محيط ها ي بيوشيميايي و آنتي سرم ها براي تشخيص گونه آن مي توان استفاده كرد.
2- استافيلوكوك Staphylococci .Sp
ميكروب گرم مثبت ، بيشتربشكل دوتايي يا هشت تايي ويا خوشه اي ديده مي شود. قطر آن كمتر از 1 ميكرون است. بدون اسپور هستند بر روي محيطgar Blood.A بخوبي رشد مي نمايد و گونه اورئوس، برنگ طلايي است نوع اپيدرميديس ،كلني سفيد تشكيل مي دهند. يا هموليتيك ß هستند يا بدون هموليز و تقريباً بيشتر آن ها كوآگولاز مثبت مي باشند .اين باكتري در سپتي سمي كرم ابريشم نقش دارد و در لنف بمقدار فراوان وجود دارد. استافيلوكوك ها قادرند مانيتول را تخمير نموده اما ژلاتين را ذوب نمي كنند. با آنتي سرم ها مي توان بعضي از آنها را اختصاصاً شناسايي كرد.
3- باسيلوس سراتيا مارسسن Serratia marcescens sp:
باسيل گرم منفي و بدون اسپور از خانواده اوباكتريال كه بيشتر آنها در 37 درجه سانتي گراد پيگمان قرمز ايجاد مي كنند.
در ابتدا در محيط هاي ائوزين متيلن بلو ( EMB ) و مك كانگي آگارMackangy agar) ( برده سپس از محيط هاي بيوشيميايي استفاده ميشود. سراتيا مارسسن سوكروز مثبت ، حركت منفي، ايندول منفي، SH2 منفي و لاكتوز مثبت و سوربيتول مثبت، را فينوز منفي، شير اسيدي كه ژلاتين را ذوب مي كند، است . همچنين اوره منفي، اكسيداز منفي، متيل ر د منفي، V-P مثبت، سيترات مثبت، هستند .
اوباكتريال ها دسته اي ازباكتر ي هاي باسيلي گرم مثبت بدون اسپور بي هوازي مي باشند كه در سپتي سمي كرم ابريشم دخالت دارند. اين باكتري ها ميله اي يا خميده بعضاً انتها گرد يا كروي بوده ، بعبارت ديگر پلي مرفيسم و كاتالاز منفي مي باشند .
نمونه ابتدا در محيط نوتر ينت آگارNutriant Agar ) (و شرايط بيهوازي بعد از 24-48 ساعت بخوبي رشد مي كنند. كلني بشكل كروي و غير هموليتيك مي باشد كه مي توان با تهيه گسترش و رنگ آميزي، اشكال پلي مرفيسم آنرا ديد. بطور كلي اوباكتريال ها غير متحرك، لاكتوز منفي، گلوكز مثبت است كه اسيد بوتير يك از آن بوجود مي آ يد و توليد گاز مي كند . اوباكتريال ها داراي 3 گونه ونتريوزم و ليموزوم و لنتوم مي باشند. ليموزوم مانيتول واريتريتول را تخمير مي نمايد. لنتوم يك گونه غير تخميري مي باشد.
باسيلوس تورينژينسيس .Sp Bacillus Thuringiensis:
اين باكتري از خانوادة* باسيلوس ها گونه اوباكتريال ها است كه بطور طبيعي در محيط پراكنده است و بيماري سوتو رادر كرم ابريشم بوجود مي*آورد. باكتري بيماري سوتو، هم به شكل رويا و هم به شكل اسپوردار ديده مي*شوداولين بار در سال1911به عنوان پاتوژن پروانه در ناحيه Thuringia آلمان مورد شناسايي قرار گرفت. اين باكتري داراي پنج تحت گونه و دو نوع توكسين مي باشد. اسپور اين باكتري توكسين دلتا (Delta endotoxin ) ايجاد نموده كه باعث مرگ كرم ابريشم مي گردد . از اين باكتري براي اولين بار به عنوان حشره كش تجارتي در فرانسه و آمريكا استفاده شد . سم اين باكتري براي انسان بيماريزا يي چنداني ندارد .
در محيطEMB بخوبي رشد مي كند . نسبت به پني سيلين مقاوم است و داراي حركت مي باشد. آزمايش لسيتيناز، احياي نيترات و هموليز ، مثبت است .
Bacillus.sp
Motality
Haemolysis
Penicillin susceptibility
Nacl %7
Virulance in mice
Crystaline parasporal inclusions
B.cereus
+
+
-
+
-
-
B.anthracis
-
-
+
+
+
-
B.thuringiensis
+
+
-
+
-
+
B.cereus mycoides
V
V
-
V
-
-
جداسازي عوامل عفوني بيماريزا و تلقيح آن به لارو سا لم ومشاهده علائم بيماري
جداسازي عوامل عفوني بيماريزا
الف : جداسازي NPV
مواد:
لارو آلوده به( NPV) ويروس پلي هدرا ي هسته اي
روش:
1- مقداري مايع همولنف را از لاروهاي آلوده به NPV جمع آوري مي كنيم
2- مايع همولنف را در محلول SDS 01/0% قرار مي دهيم.
3- آن ها را از پارچه گاز فيلتر مي كنيم.
4- مايع خارج شده از فيلتر را بمدت 10 دقيقه با دور 3000 سانتريفوژ مي كنيم
5- رسوب بعضاً شامل (NPV )ويروس پلي هدرا ي هسته اي خالص است.
6- آن را مجددا در محلول SDS 01/0% قرار مي دهيم.
7- در ادامه آنرا بمدت 30 دقيقه با دور 2400 كه سانتريفوژ مي كنيم.
8- NPV پلي هد راي هسته اي جدا مي شود.
9- آن را در آب مقطر مي ريزيم.
10- بمدت 10 دقيقه با دور 3000 سانتريفوژ مي كنيم.
11- رسوب NPV خالص است.
12- رسوب را در آب مقطر مي ريزيم.
13- بوسيله هموسيتومتر ميزان 107 ميلي ليتر پلي هدراي شمارش مي كنيم.
14- با دستكش برگ توت تهيه مي كنيم.
15- پلي هدراي خالص در پتريديش مي ريزيم.
16- بوسيله برس برگ ها را به NPV آلوده مي كنيم
17- در هواي آزاد آن ها را خشك مي كنيم و از آن براي تغذيه لارو سالم استفاده مي نماييم.
نتيجه:
بعد از 5-4 روز لارو ها با NPV آلوده مي شوند. تورم بين بندي، تلالوء پوست برنگ شيري – سفيد، خزيدن لارو به لبه هاي سيني پرورش از علائم ظاهر شده مي باشد.
ب: جداسازي موسكاردين:
مواد:
108 ميلي ليتر اسپور موسكاردين، 20 لارو
روش:
1- لارو آلوده به موسكاردين سفيد را در آب مقطر فرو مي كنيم.
2- اسپور موسكاردين سفيد را از لارو جدا مي كنيم .
3- مايع را از گاز عبور مي دهيم.
4- آنرا بمدت 10 دقيقه با دور 2500 سانترفوژ مي كنيم.
5- رسوب تقريباً كونيدياي موسكاردين است.
الف: تلقيحNPV:
مواد:پلي هدرا NPV، پتريديش، برس، لارو جوان و سالم
روش:
1- 5 ميلي ليتر از 107 ميلي ليتر NPV محلول، را درون پتريديش به قطر 13 سانتي متر مي ريزيم و تا در محيط اتاق خشك شود.
2- پتريديش را بعد از خشك كردن محتويات، بر روي سيني پرورش قرار مي دهيم.
3- بعد از يك شب، محتويات پتريديش همراه با 5 ميلي ليتر آب مقطر مخلوط مي كنيم.
4- مقدراي برگ توت را با اين سوسپانسيون NPV بوسيله يك برس آغشته و آلوده مي كنيم و در هواي اتاق خشك مي كنيم.
5- برگ ها را بوسيله قيچي خرد مي كنيم و لاروهاي جوان را بوسيله آن ها تغذيه مي نماييم.
6- در ادامه تغذيه با برگ هاي مغذي ادامه مي يابد.
7- علائم NPV را مشاهده مي كنيم.
8- لاروهاي بيمار را يك يا دوبار هر روز خارج مي كنيم .
نتيجه:
لارو بيمار اشتهاي خود را از دست مي دهدو پوست حالت الاستيسيته طبيعي خود را نداردو درخشان مي شود .آن ها همچنين بي طاقت و پر جنب و جوش مي شوند. مايع لنف شفافيت خود را از دست مي دهد و بهنگام پاره شدن پوست، لنف شيري رنگ ، از آن خارج مي گردد.
ب: تلقيح موسكاردين:
مواد و ملزومات:
108 ميلي ليتر موسكاردين سفيد، 20 عدد لارو سالم
روش:*
1- 108 ميلي ليتر محلول حاوي موسكاردين سفيد تهيه مي كنيم.
2- 20 عدد لارو سالم كه پوست اندازي مرحله دوم را انجام داده باشند را در يك پتري ديش گذا شته و لاروها را با محلول حاوي اسپور موسكاردين سفيد بوسيله برس بر روي پوست آلوده مي كنيم.
3- پتري ديش محتوي لاروهاي آلوده را بر روي سبد پرورش مي گذاريم.
بعد از يك شب آن ها را تغذيه كرده و مدت يك هفته ادامه مي دهيم .
علائم را در لاروها ثبت و گزارش تلفات را مي دهيم.
نتيجه:
آلودگي اصلي از طريق پوست به بدن سرايت ميكند ضمن پيشرفت بيماري لكه هاي روغني بر روي پوست مشاهده مي شود. قبل از مرگ اسهال و استفراغ در لارو بيمار رخ مي دهد.
آزمايش پروانه هاي توليد كننده تخم نوغان از نظر پبرين
مجموعه مورد آزمايش :
تخم هاي اجداد: 2-1 پروانه
تخم هاي مادر: 28-2 پروانه
تخم هاي توليد نوغان يا توليد پيله : 40-30 پروانه
مواد:
KoH 2%
Co3k2 5/0%
روش:
تهيه نمونه:
1- تهيه پروانه بلافاصله پس از تخمگذاري
2- پروانه را در درجه حرارت 75-65 درجه سانتيگراد انكوباتور خشك مي كنيم .
3- سپس با محلول KOH 2% يا CO3K25/0% نرم و مخلوط (بمدت 5-3 دقيقه) شود .
4- افزودن آب مقطر به آن
5- صاف نمودن بوسيله گاز
6- سانتريفوژ در دور 250 براي 3 دقيقه يا بمدت 48 ساعت كنار گذاشتن و آزمايش رسوب قسمت پايين آن
7- تهيه گسترش از رسوب بر روي لام
8- آزمايش از يك پروانه بر روي يك لام
9- حفظ و نگهداري تمامي رسوب تا پايان تشخيص
10- هر اسلايد دو مرتبه دقيقاً بررسي شود و هر مورد (پروانه) نيز براي 5 مرتبه آزمايش شوند.
نتيجه:
اگر پروانه داراي اسپور و يا پلي هدرا بود از توليد حذف و اگر منفي بود براي توليد پذيرفته مي شود.
اگر انواع ديگر ميكروسپوريديا پيدا شد بايد آزمايشات دقيق تفريق تشخيصي پبرين انجام شود.
آزمايش تخم از نظر پبرين و پلي هدرا
واحدهاي آزمايش:
تخم هاي لاين يا لاين هاي وارداتي
تخم هاي اجداد 2-1 پروانه
تخم هاي مادر 5-3 پروانه
روش: آن ها را در شرايط زير پرورش مي دهيم سپس لارو را مورد آزمايش قرار مي د هيم.
رطوبت
حرارت
زمان
80%
15
5 روز
مرحله اول
80%
20
تا بيرون آمدن
مرحله دوم
لاروهاي از تخم درآمده ، در 20 درجه سانتي گراد بدون غذا تا هنگام انجام آزمايشات تشخيص پبرين و پلي هدرا، نگهداري مي شوند، تا بميرند و سپس از نظر عامل پبرين و پلي هدرا مورد آزمايش مستقيم وتكميلي قرار مي گيرند.
نمونه گيري بيماري هاي تك ياخته اي كرم ابريشم در كنار يخ و به وسيله دامپزشك ياكاردان دامپزشكي انجام مي شود
به منظور تشخيص مستقيم پبرين ، مي توان از دو روش زير استفاده نمود :
1- تهيه لام مرطوب : از جدار روده لارو بيمار ، مستقيما برداشت شده و به آن يك قطره آب يا پتاس اضافه مي نماييم ، پس از قرار دادن يك لامل بر روي آن و با روغن ايمرسون و عدسي 100 ، مشاهده صورت مي گيرد.
2-رنگ آميزي
الف: رنگ آميزي گيمسا: اين رنگ آميزي بيشتر براي تشخيص اسپور پبرين كاربرد دارد و لي مي تواند به منظور تفريق با فارچ ها، پلي هدراي ويروس هسته اي و سيتوپلاسمي نيز بكار رود.
مواد:
محلول گيمساي غليظ: مواد : پودر گيمسا 1 گرم گليسرول 54 ميلي ليتر
متيل الكل 84 ميلي ليتر
روش توليد پودر گيمسا:
پودر گيمسا را به گليسرول افزوده و به ميزان 60-56 درجه سانتيگراد بمدت 1 ساعت ضمن تكان دادن و هم زدن، حرارت مي دهيم. سپس متيل الكل را افزوده و هم مي زنيم و بمدت 4-2ساعت در درجه حرارت اتاق مي گذاريم بماند .بعد از گذشت اين مدت ، بوسيله فيلتر كاغذي آن را فيلتر نموده و محلول فيلتره شده ، محلول غليظ گيمسا است و مي توانيم در شيشه كوچك رنگي در حرارت اتاق نگهداري كنيم.
روش هاي رنگ آميزي با گيمسا:*
ابتدا مقداري از نمونه را در محلول KOH حل كرده سپس 2-1 قطره از محلول را بر روي لام گسترش داده و در حرارت معمولي آزمايشگاه خشك مي كنيم.
سپس آن را در محلول گيمساي رقيق شده (1 قسمت گيمسا غليظ + 2 قسمت آب مقطر) قرار مي دهيم و براي 2-1 دقيقه روي شعله مي گيريم .
در روشي ديگر مي توانيم گسترش را در محلول گيمساي رقيق شده بطور افقي ، به مدت چهل وپنج دقيقه قرار دهيم . يا اينكه مي توانيم يك قطره گيمساي غليظ را به مدت 5 دقيقه روي گسترش قرار داده و 30 ثانيه به آرامي حرارت دهيم .سپس با*آب آن را شستشو داده و خشك مي كنيم و با روغن ايمرسون و عدسي 100 ميكروسكوپ مشاهده مي نماييم.
نتايج:
اسپور پبرين بعضاً رنگ مي گيرد.
پلي هدراي ويروس هسته اي: رنگ نمي گيرد.
پلي هدرا ي ويروس سيتوپلاسمي : رنگ مي گيرد.
موسكاردين سبز: تماماً رنگ مي گيرد.
ب: رنگ آميزي سبز مالاشيت
مواد:
سبز مالاشيت مايع 5% مركوروكرم 5% سافرانين 25/0%
روش:
1- تهيه گسترش از نمونه و تثبيت آن بوسيله حرارت
2- قرار دادن لام در مايع سبز مالاشيت بمدت 10 دقيقه
3- تجديد مرتب مايع سبز مالاشيت
4- شستن لام بوسيله آب
5- قرار دادن لام درون ظرف محتوي مركوروكرم يا سافرانين بمدت 15 ثانيه
6- شستن لام بوسيله آب و خشك كردن
نتيجه : بوسيله ميكروسكوپ ، با روغن ايمرسون و عدسي 100 اگر نمونه مثبت باشد ،اسپوربه رنگ قرمزدر زمينه سبز مشاهده مي شود .
آزمايشات تكميلي تشخيص پبرين
اگر تشخيص مستقيم پبرين كه با تهيه لام مرطوب وبرداشت مستقيم از روده لارو بيمار با لامل يا رنگ آميزي گسترش مستقيم از روده لارو بيمار با گيمساي رقيق، صورت مي گيرد مثبت باشد،يعني اسپور تخم مرغي مشاهده شود، مي توان با آزمايش هاي زير به تشخيص قطعي رسيد.
الف: روش خروج تاژك قطبي
مواد: محلولH2O2
محلول مولار 25/0 KCL
روش:
1- تهيه گسترش بر روي لام
2- خشك كردن در هواي محيط
3- افزودن يك قطره از محلول هاي H2O2و KCL
4- گذاشتن لامل
5- خشك كردن لام در 30 درجه سانتيگراد براي 40 دقيقه
6- مشاهده باعدسي 40 ميكرسكوپ
نتيجه:
اگر يك فيلامان يا تاژك قطبي از اسپور خارج شده باشد اين اسپور، پبرين است.
ب: روش اسيد:
مواد: محلول اسيد HCL 37% (غليظ)
روش:
1- تهيه گسترش از جدار روده لارو بيمار
2- خشك كردن در هواي معمولي اتاق
3- افزودن يك قطره اسيد و گذاشتن لامل
4- مشاهده باعدسي 40 ميكرسكوپ
در اين روش همه اسپورهاي ناشناخته به استثناء پبرين بوسيله اسيد از بين مي رود.
ج: روش حرارت:
مواد: KOH 20%
روش:
1- تهيه گسترش
2- نگهداري لام در درجه حرارت 130-110 درجه سانتيگراد بمدت 5-3 ساعت
3- مشاهده اسپور با عدسي 40 ميكروسكوپ
4- افزودن محلول KOH %20 بمدت 30-20 دقيقه
5- مشاهده مجدد اسپور
نتيجه:
شكل پبرين در حرارت اوليه تغيير مي كند سپس با محلول KOH مجدداٌ بحالت و شكل اصلي خود برمي گردد.
د: *روش رنگ آميزي
محلول سافرانين سافرانين 25 0 /0گرم
اتيل الكل 99% 10 ميلي ليتر آب مقطر 100 ميلي ليتر
روش:*
1- تهيه گسترش
2- خشك كردن لام بحالت افقي
3- افزودن يك قطره رنگ سافرانين به مدت 5 دقيقه
4- حرارت دادن آرام لام براي 30 ثانيه
5- شستن با* آب معمولي و گذاشتن لامل
6- مشاهده با روغن ايمرسون و عدسي 100 ميكرسكوپ
نتيجه:
در رنگ آميزي با سافرانين هسته اسپورپبرين قرمز تيره و پروتوپلاسم برنگ قرمز روشن در مي آيد.
تشخيص ويروس پلي هدرا ي هسته اي
نمونه گيري بيماري ها ي ويروسي در كنار يخ و به وسيله دامپزشك ياكارذان دامپزشكي انجام مي شود.
1- تشخيص مستقيم : به منظور مشاهده مستقيم پلي هدرا ي چند وجهي ، يك قطره از لنف لارو مشكوك به بيماري را ، بر روي لام گذاشته و لامل را روي آن قرار مي دهيم و با عدسي 40 ميكروسكوپ مشاهده مي نماييم .
نتيجه :
اگر نمونه مثبت باشد، پلي هدرا ي چند وجهي، بي رنگ و براق، بحالت شناور ، مشاهده مي شود.
2- رنگ آميزي
الف : رنگ آميزي بلودو متيلن
مواد: پودر بلودو متيلن 5/2 گرم الكل اتيليك 95 % 100 ميلي ليتر
روش :يك قطره از لنف را ، روي لام گذاشته و با حرارت آن را تثبيت مي كنيم و سپس رنگ را به مدت يك دقيقه روي لام مي دهيم.
نتيجه:
در اين رنگ آميزي، مشاهده لام با عدسي 100 و روغن ايمرسون صورت مي گيردو زمينه لام آبي رنگ و پلي هدرا ي چند وجهي هسته اي رنگ نگرفته مشاهده مي شود و پلي هدراي سيتوپلاسمي رنگ آبي را به خود مي گيرد .
تشخيص بيماري هاي قارچي
نمونه گيريبيماري هاي قارچي در كنار يخ و به وسيله دامپزشك يا كاردان دامپزشكي انجام مي شود.
الف: گسترش مستقيم : مي توان گسترش مستقيم را از سطح پوست بدن كرم ابريشم ، با يك قطره آب يا يك قطره پتاس تهيه نمودو با عدسي 40 مشاهده كرد.
ب: رنگ آميزي(Lactophenol-cotton blue)
مواد:
فنل، ذوب شده ( بااحتياط) 20 گرم اسيد لاكتيك 20 ميلي ليتر
گليسيرين 40 ميلي ليتر آب مقطر 20 ميلي ليتر
cotton blue(methyl blue) % 0/05
روش: آب گرم را به فنل ذوب شده افزوده و اسيد لاكتيك و گليسيرين را بآن اضافه مي كنيم سپس رنگبي متيل5/0% را به لاكتوفنل مي افزاييم.
نتيجه:
1 -موسكاردين :
در گسترش مرطوب از ميسليوم ها كه مختصري حالت پودري و كرك مانند دارند، مي توان كونيدياي منفرد را ، در گروه هاي نامنظم يا خوشه اي سربالا ديد. در بعضي انواع، قسمت هاي پايه، قطور اما در انتها نوك تيز مي شود، كه بعد از چندين تقسيم بحالت زيگزاكي قرار مي گيرند. به عبارت ديگركونيديا داراي شاخه هاي منشعب با محورهاي جداگانه وگرد است كه كمتر تك سلولي بوده ودر انتها دندانه هاي كوچك منفردي را ايجاد مي نمايند و انگل حشرات نيز هستند.
2- آسپرژيلوس: در گسترش مرطوب كونيديوفور عمودي و مسقيم، ساده و در انتها گرد و برآمده،يا بعبارتي چماقي شكل است كه داراي شعاع هايي در بالاي سر يا در تمام سطح مي باشد و كونيديا شعاعي با محورهاي جدا گانه است.
د:كشت قارچ
از محيط سابور دكستروز آگار به منظور كشتقارچي براي قارچ هاي بيماريزا ي موسكاردين و آسپرژيلوس استفاده مي شود. پس از رشد قارچ با تهيه لام مرطوب آن را مشاهده مي نماييم .
تشخيص باكتريايي
نمونه گيري بيماري هاي باكتريايي در كنار يخ و به وسيله دامپزشك يا كاردان دامپزشكي انجام مي شود.
1- استرپتوكوك Streptococci. Sp
همه انواع استرپتو كوك ميتواننددر بيماريزائي كرم ابريشم نقش داشته باشند. در سپتي سمي ،آلودگي بيشتر از طريق ضربه*ها و زخم ها و بندرت از طريق دهاني صورت مي*گيرد. در بيماري هاي گوارش كرم ابريشم آلودگي بيشتر از طريق دهاني صورت مي*گيرد.
براي جداسازي انواع استرپتو كوك ، بهترين محيط Blood. Agar است .كه در اين محيط اگر نمونه استرپتو كوك مثبت باشد، مي توان هموليز ß يا* a را در آن مشاهده كرد و با گرفتن گسترش و رنگ آميزي گرم و ديدن باكتري گرم مثبت كروي به قطر8/0- 6/0ميكرون كه بشكل دانه ها ي تسبيح بدنبال هم قرارگرفته اند، تشخيص قطعي است.
اين باكتري ، كاتالاز منفي است وآزمايش كاتالاز آن را از استافيلوكوك تفريق مي كند. در صورت لزوم از محيط ها ي بيوشيميايي و آنتي سرم ها براي تشخيص گونه آن مي توان استفاده كرد.
2- استافيلوكوك Staphylococci .Sp
ميكروب گرم مثبت ، بيشتربشكل دوتايي يا هشت تايي ويا خوشه اي ديده مي شود. قطر آن كمتر از 1 ميكرون است. بدون اسپور هستند بر روي محيطgar Blood.A بخوبي رشد مي نمايد و گونه اورئوس، برنگ طلايي است نوع اپيدرميديس ،كلني سفيد تشكيل مي دهند. يا هموليتيك ß هستند يا بدون هموليز و تقريباً بيشتر آن ها كوآگولاز مثبت مي باشند .اين باكتري در سپتي سمي كرم ابريشم نقش دارد و در لنف بمقدار فراوان وجود دارد. استافيلوكوك ها قادرند مانيتول را تخمير نموده اما ژلاتين را ذوب نمي كنند. با آنتي سرم ها مي توان بعضي از آنها را اختصاصاً شناسايي كرد.
3- باسيلوس سراتيا مارسسن Serratia marcescens sp:
باسيل گرم منفي و بدون اسپور از خانواده اوباكتريال كه بيشتر آنها در 37 درجه سانتي گراد پيگمان قرمز ايجاد مي كنند.
در ابتدا در محيط هاي ائوزين متيلن بلو ( EMB ) و مك كانگي آگارMackangy agar) ( برده سپس از محيط هاي بيوشيميايي استفاده ميشود. سراتيا مارسسن سوكروز مثبت ، حركت منفي، ايندول منفي، SH2 منفي و لاكتوز مثبت و سوربيتول مثبت، را فينوز منفي، شير اسيدي كه ژلاتين را ذوب مي كند، است . همچنين اوره منفي، اكسيداز منفي، متيل ر د منفي، V-P مثبت، سيترات مثبت، هستند .
اوباكتريال ها دسته اي ازباكتر ي هاي باسيلي گرم مثبت بدون اسپور بي هوازي مي باشند كه در سپتي سمي كرم ابريشم دخالت دارند. اين باكتري ها ميله اي يا خميده بعضاً انتها گرد يا كروي بوده ، بعبارت ديگر پلي مرفيسم و كاتالاز منفي مي باشند .
نمونه ابتدا در محيط نوتر ينت آگارNutriant Agar ) (و شرايط بيهوازي بعد از 24-48 ساعت بخوبي رشد مي كنند. كلني بشكل كروي و غير هموليتيك مي باشد كه مي توان با تهيه گسترش و رنگ آميزي، اشكال پلي مرفيسم آنرا ديد. بطور كلي اوباكتريال ها غير متحرك، لاكتوز منفي، گلوكز مثبت است كه اسيد بوتير يك از آن بوجود مي آ يد و توليد گاز مي كند . اوباكتريال ها داراي 3 گونه ونتريوزم و ليموزوم و لنتوم مي باشند. ليموزوم مانيتول واريتريتول را تخمير مي نمايد. لنتوم يك گونه غير تخميري مي باشد.
باسيلوس تورينژينسيس .Sp Bacillus Thuringiensis:
اين باكتري از خانوادة* باسيلوس ها گونه اوباكتريال ها است كه بطور طبيعي در محيط پراكنده است و بيماري سوتو رادر كرم ابريشم بوجود مي*آورد. باكتري بيماري سوتو، هم به شكل رويا و هم به شكل اسپوردار ديده مي*شوداولين بار در سال1911به عنوان پاتوژن پروانه در ناحيه Thuringia آلمان مورد شناسايي قرار گرفت. اين باكتري داراي پنج تحت گونه و دو نوع توكسين مي باشد. اسپور اين باكتري توكسين دلتا (Delta endotoxin ) ايجاد نموده كه باعث مرگ كرم ابريشم مي گردد . از اين باكتري براي اولين بار به عنوان حشره كش تجارتي در فرانسه و آمريكا استفاده شد . سم اين باكتري براي انسان بيماريزا يي چنداني ندارد .
در محيطEMB بخوبي رشد مي كند . نسبت به پني سيلين مقاوم است و داراي حركت مي باشد. آزمايش لسيتيناز، احياي نيترات و هموليز ، مثبت است .
Bacillus.sp
Motality
Haemolysis
Penicillin susceptibility
Nacl %7
Virulance in mice
Crystaline parasporal inclusions
B.cereus
+
+
-
+
-
-
B.anthracis
-
-
+
+
+
-
B.thuringiensis
+
+
-
+
-
+
B.cereus mycoides
V
V
-
V
-
-
جداسازي عوامل عفوني بيماريزا و تلقيح آن به لارو سا لم ومشاهده علائم بيماري
جداسازي عوامل عفوني بيماريزا
الف : جداسازي NPV
مواد:
لارو آلوده به( NPV) ويروس پلي هدرا ي هسته اي
روش:
1- مقداري مايع همولنف را از لاروهاي آلوده به NPV جمع آوري مي كنيم
2- مايع همولنف را در محلول SDS 01/0% قرار مي دهيم.
3- آن ها را از پارچه گاز فيلتر مي كنيم.
4- مايع خارج شده از فيلتر را بمدت 10 دقيقه با دور 3000 سانتريفوژ مي كنيم
5- رسوب بعضاً شامل (NPV )ويروس پلي هدرا ي هسته اي خالص است.
6- آن را مجددا در محلول SDS 01/0% قرار مي دهيم.
7- در ادامه آنرا بمدت 30 دقيقه با دور 2400 كه سانتريفوژ مي كنيم.
8- NPV پلي هد راي هسته اي جدا مي شود.
9- آن را در آب مقطر مي ريزيم.
10- بمدت 10 دقيقه با دور 3000 سانتريفوژ مي كنيم.
11- رسوب NPV خالص است.
12- رسوب را در آب مقطر مي ريزيم.
13- بوسيله هموسيتومتر ميزان 107 ميلي ليتر پلي هدراي شمارش مي كنيم.
14- با دستكش برگ توت تهيه مي كنيم.
15- پلي هدراي خالص در پتريديش مي ريزيم.
16- بوسيله برس برگ ها را به NPV آلوده مي كنيم
17- در هواي آزاد آن ها را خشك مي كنيم و از آن براي تغذيه لارو سالم استفاده مي نماييم.
نتيجه:
بعد از 5-4 روز لارو ها با NPV آلوده مي شوند. تورم بين بندي، تلالوء پوست برنگ شيري – سفيد، خزيدن لارو به لبه هاي سيني پرورش از علائم ظاهر شده مي باشد.
ب: جداسازي موسكاردين:
مواد:
108 ميلي ليتر اسپور موسكاردين، 20 لارو
روش:
1- لارو آلوده به موسكاردين سفيد را در آب مقطر فرو مي كنيم.
2- اسپور موسكاردين سفيد را از لارو جدا مي كنيم .
3- مايع را از گاز عبور مي دهيم.
4- آنرا بمدت 10 دقيقه با دور 2500 سانترفوژ مي كنيم.
5- رسوب تقريباً كونيدياي موسكاردين است.
الف: تلقيحNPV:
مواد:پلي هدرا NPV، پتريديش، برس، لارو جوان و سالم
روش:
1- 5 ميلي ليتر از 107 ميلي ليتر NPV محلول، را درون پتريديش به قطر 13 سانتي متر مي ريزيم و تا در محيط اتاق خشك شود.
2- پتريديش را بعد از خشك كردن محتويات، بر روي سيني پرورش قرار مي دهيم.
3- بعد از يك شب، محتويات پتريديش همراه با 5 ميلي ليتر آب مقطر مخلوط مي كنيم.
4- مقدراي برگ توت را با اين سوسپانسيون NPV بوسيله يك برس آغشته و آلوده مي كنيم و در هواي اتاق خشك مي كنيم.
5- برگ ها را بوسيله قيچي خرد مي كنيم و لاروهاي جوان را بوسيله آن ها تغذيه مي نماييم.
6- در ادامه تغذيه با برگ هاي مغذي ادامه مي يابد.
7- علائم NPV را مشاهده مي كنيم.
8- لاروهاي بيمار را يك يا دوبار هر روز خارج مي كنيم .
نتيجه:
لارو بيمار اشتهاي خود را از دست مي دهدو پوست حالت الاستيسيته طبيعي خود را نداردو درخشان مي شود .آن ها همچنين بي طاقت و پر جنب و جوش مي شوند. مايع لنف شفافيت خود را از دست مي دهد و بهنگام پاره شدن پوست، لنف شيري رنگ ، از آن خارج مي گردد.
ب: تلقيح موسكاردين:
مواد و ملزومات:
108 ميلي ليتر موسكاردين سفيد، 20 عدد لارو سالم
روش:*
1- 108 ميلي ليتر محلول حاوي موسكاردين سفيد تهيه مي كنيم.
2- 20 عدد لارو سالم كه پوست اندازي مرحله دوم را انجام داده باشند را در يك پتري ديش گذا شته و لاروها را با محلول حاوي اسپور موسكاردين سفيد بوسيله برس بر روي پوست آلوده مي كنيم.
3- پتري ديش محتوي لاروهاي آلوده را بر روي سبد پرورش مي گذاريم.
بعد از يك شب آن ها را تغذيه كرده و مدت يك هفته ادامه مي دهيم .
علائم را در لاروها ثبت و گزارش تلفات را مي دهيم.
نتيجه:
آلودگي اصلي از طريق پوست به بدن سرايت ميكند ضمن پيشرفت بيماري لكه هاي روغني بر روي پوست مشاهده مي شود. قبل از مرگ اسهال و استفراغ در لارو بيمار رخ مي دهد.
آزمايش پروانه هاي توليد كننده تخم نوغان از نظر پبرين
مجموعه مورد آزمايش :
تخم هاي اجداد: 2-1 پروانه
تخم هاي مادر: 28-2 پروانه
تخم هاي توليد نوغان يا توليد پيله : 40-30 پروانه
مواد:
KoH 2%
Co3k2 5/0%
روش:
تهيه نمونه:
1- تهيه پروانه بلافاصله پس از تخمگذاري
2- پروانه را در درجه حرارت 75-65 درجه سانتيگراد انكوباتور خشك مي كنيم .
3- سپس با محلول KOH 2% يا CO3K25/0% نرم و مخلوط (بمدت 5-3 دقيقه) شود .
4- افزودن آب مقطر به آن
5- صاف نمودن بوسيله گاز
6- سانتريفوژ در دور 250 براي 3 دقيقه يا بمدت 48 ساعت كنار گذاشتن و آزمايش رسوب قسمت پايين آن
7- تهيه گسترش از رسوب بر روي لام
8- آزمايش از يك پروانه بر روي يك لام
9- حفظ و نگهداري تمامي رسوب تا پايان تشخيص
10- هر اسلايد دو مرتبه دقيقاً بررسي شود و هر مورد (پروانه) نيز براي 5 مرتبه آزمايش شوند.
نتيجه:
اگر پروانه داراي اسپور و يا پلي هدرا بود از توليد حذف و اگر منفي بود براي توليد پذيرفته مي شود.
اگر انواع ديگر ميكروسپوريديا پيدا شد بايد آزمايشات دقيق تفريق تشخيصي پبرين انجام شود.
آزمايش تخم از نظر پبرين و پلي هدرا
واحدهاي آزمايش:
تخم هاي لاين يا لاين هاي وارداتي
تخم هاي اجداد 2-1 پروانه
تخم هاي مادر 5-3 پروانه
روش: آن ها را در شرايط زير پرورش مي دهيم سپس لارو را مورد آزمايش قرار مي د هيم.
رطوبت
حرارت
زمان
80%
15
5 روز
مرحله اول
80%
20
تا بيرون آمدن
مرحله دوم
لاروهاي از تخم درآمده ، در 20 درجه سانتي گراد بدون غذا تا هنگام انجام آزمايشات تشخيص پبرين و پلي هدرا، نگهداري مي شوند، تا بميرند و سپس از نظر عامل پبرين و پلي هدرا مورد آزمايش مستقيم وتكميلي قرار مي گيرند.