بررسي ميزان توليد نيتريك اكسايد در عفونت تجربي ماكيان
بررسی میزان تولید نیتریک اکساید (NO) در عفونت تجربی ماکیان با توکسوپلاسما گوندی
حمیدرضا خدائی1 ، سید حسین حجازی۲
چکیده:
توکسوپلاسما گوندی انگل اجباری درون یاخته ای است که توانایی آلوده کنندگی بسیاری از مهره داران را داراست.مکانیسم های دفاعی متعددی توسط میزبان علیه این انگل وجوددارد.اما آنچه در سالهای اخیر مطرح شده است ، تولید مولکول NO می باشد.هدف از انجام چنین مطالعه ای بررسی میزان تولید NO علیه انگل توکسوپلاسما در مرغان بود. برای این منظور مرغهای انتخاب شده با سویه ای تخفیف حدت داده شده از انگل تلقیح شده نیز همانند پستانداران جهت دفاع ، (NO) تولید می کنند اما میزان تولید NO در شرایط مزمن و حاد بیماری با یکدیگر متفاوت است . به نحوی که در شرایط حاد احتمالا مکانیسم های دیگری به جز تولید NO مطرح است ، در حالیکه در شرایط مزمن بیماری غلظت NOاثر انگل کشی خود را اعمال می کند.
کلید واژه ها : نیتریک اکساید ، ماکیان ، توکسوپلاسموز
۱- هیات علمی دانشگاه آزاد اسلامی- خوراسگان(واحد گلپایگان)
۲-استادیار دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (متخصص ایمنوپارازیتولوژی - مدیر گروه بخش انگل و قارچ دانشکده پزشکی)
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Nitric oxide (NO) production study in domestic fowl produced by toxoplasma gondii
Khodaee ,H. R.¹ and S. H. Hejazy²
Abstract:
Study of nitric oxide (NO) production during experimental infection with toxoplasma gondii toxoplasma is a parasite of cosmopolitian distribution , able develop in a wide variety of vertebrate hosts. The aim of the present experiment was to study for production of nitric oxide (NO) during infection with Toxoplasma gondii. chickens were infected by administering the various dosages (0 cyst until 30 cysts) of parasite in 1-5 aqueous suspensions. NO production was estimated by Griess reaction. The results shows NO production increased after administration of variouse toxoplasma cysts. During infection chicknes synthesize large quantities of NO; while the rate of production of NO was differents in an acute case in compartion with choronic one. These results suggest that NO may play an important part in controling of choronic toxoplasmosis in chickens.
key words: toxoplasma , nitric oxide , chickens
1- Khorasgan(Golpayegan) Azad Univesity
2- Isfahan Medicine University
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
<
مقدمه:
Toxoplasma gondii انگل اجباری درون یاخته ای هسته دار است که طیف گسترده ای از پستانداران ، پرندگان و خزندگان ، میزبان واسط آن هستند. گزارشهای متعدد نشان می دهد آلودگی میزبان پستاندار به انگل توکسوپلاسما موجب واکنشهای پی در پی ایمنی می شود که از تولید اینترلوکین ۱۲ آغاز شده و پس از فعال شدن اینترفرون گاما و تولید فاکتور نکروزدهنده تومور (TNFa) منجر به تولید آنزیم سنتز کننده نیتریک اکساید(iNOS)می شود و نیتریک اکساید (NO)احتمالا اثر سمی بر انگل می گذارد.NO در بدن نقشهای گوناگون دارد. از فعالیتهای فیزیولوژیک تا پاتولوژیک NO رادیکال آزاد گازی شکلی است که اثر خود را عمدتا از طریق شکل دهی cGMP نشان می دهد. در این میان، ماکیان نیز به توکسوپلاسموز مبتلا می شوند، اما تا کنون مطالعات زیادی پیرامون چگونگی واکنش ماکیان علیه این انگل گزارش نشده است. این در حالی است که بیماری حاد ناشی از توکسوپلاسما در پرندگان با مرگ همراه است و قبل از مرگ علایمی همچون برگشتگی سر ،لرزیدن بدن و عدم تعادل در پرنده به چشم می خورد. از لحاظ تحقیقات اپیدمیولوژی وجود این انگل در ماکیان ایران به اثبات رسیده است. تحقیقات نشان داد، بسیاری از ماکیان ایران به انگل آلوده اند.در یک بررسی وجود آنتی بادی علیه توکسوپلاسما را در مرغان تخمگذار و مادر ، در استان اصفهان گزارش کردند.
اهداف اصلی از انجام اینطرح عبارت بودند از: بررسی نوع دفاع ایمنولوژیک مرغان علیه عفونتهای داخل سلولی و مقایسه آن با پستانداران ، راه اندازی شیوه اندازهگیری متابولیتهای پایدار نیتریک اکساید در مایعات بیولوژیک.
مواد و روش ها :
تعداد ۵۰قطعه نیمچه تخمگذار تجاری با میانگین سنی (۱±۱۴) هفته انتخاب شدند. نیمچه ها از نظر آلودگی به انگل توکسوپلاسما از طریق آزمایش هم آگلوتیناسیون غیر مستقیم (IHA) بررسی شدند که همگی سالم بودند. نیمچه ها در طول آزمایش در قفسهایی با ظرفیت ۵ عدد نگهداری می شدند. جیره غذایی آنها بر اساس توصیه (۱۹۹۴) NRC و توسط متخصص تغذیه مرغداری تهیه شد. آب بطور آزاد در اختیار مرغان قرار داشت. در طول آزمایش دمای محیط و شرایط نوری با توجه به شرایط سنی مرغان تنظیم بود. زمان انجام آزمایش تابستان ۱۳۸۱ بود.سویه ME-49 انگل (به عنوان سویه ایی که در بسیاری از تحقیقات کاربرد دارد و توسط شرکت تولید کننده از سلولهای اپی تلیال روده گربه تهیه می شود) خریداری شد. این سویه ها قبل از تزریق تخفیف حدت داده شدند. به این ترتیب که سویه ها به صورت داخل دیافراگمی (IP) به موشهای سفید آزمایشگاهی تزریق شد.۳-۴ هفته بعد موشها به وسیله اتر کشته شدند و سوسپانسیون هموژن مغز آنها تهیه شد. سوسپانسیونها بهشیوه ای تقسیم بندی شدند که هر ۱ میلی لیتر از آنها حداقل ۱۰۰ سیست انگل قابل شناسایی بود. سپس بر اساس تیمارهای طراحی شده به گروه های مختلف نیمچه ها تزریق انجام شد.
مجموعا ۱۰ قفس وجود داشت ، بنابراین هر تیمار به ۲ قفس اعمال شد . تیمارها عبارت بودند از :
(۱)گروه شاهد; تزریق cc ۰/۵ از سوسپانسیون (صفر سیست)
(۲)تیمار اول;تزریق cc ۰/۱ از سوسپانسیون(۱۰ سیست)
(۳)تیمار دوم;تزریق cc ۰/۲ از سوسپانسیون(۲۰ سیست)
(۴)تیمار سوم;تزریق cc ۰/۳ از سوسپانسیون(۳۰ سیست)
(۵)تیمار چهارم;تزریق cc ۰/۵ از سوسپانسیون(۵۰ سیست)
نمونه گیری خون در ۳ نوبت پس از آلوده نمودن نیمچه ها (روز ۸،۴و۱۲) انجام شد. خونگیری به میزان ۵cc و از طریق سیاهرگ بالی پرنده بعمل آمد. برای خونگیری از لوله های آزمایش حاوی EDTA استفاده شد. دمای نمونه های تهیه شده سریعا بوسیله یخ کاهش یافت و سپس در ساعت نخست نمونه گیری سانتریفوژ شد تا پلاسما به دست آید. پلاسما تا زمان انجام آزمایش در دمای ۲۲-˚C نگهداری می شد.
NO گازی بسیار ناپیدار است که سریعا به متابولیتهای پایدار خود NO2 وNO3 تبدیل می شود. اساس اندازه گیری بر اساس استفاده از معرف گریس (Greiss)بود. این معرف مخلوطی است از (نفتالین دی هیدروکلراید ۱/۰٪ ، سولفانیلامید ۱٪ و اسید فسفریک ۵/۲٪)که از شرکت Sigma تهیه شد.۵۰ میکرولیتر از پلاسما به دست آمده با ۵۰ میکرولیتر از محلول گریس در گوده های پلیت مخلوط گردید. ۱۵ دقیقه در دمای اتاق اینکوبه شد و سپس توسط ELISA-Reader از نوع Statax303،جذب نوری در طول موج ۵۴۰ نانومتر با طول موج رفرنس ۶۳۰ نانومتر قرائت شد. معرف گریس قادر به اندازه گیری NO3(نیترات) نمی باشد. به همین دلیل از گرانولهای عنصر کادمیم (Cd) که توانائی احیای نیترات را دارد استفاده شد. به ازای هر نمونهgr۰/۵ کادمیم شسته شده با آب مقطر ،HCI (مولار ۱/۰)و NH4OH (مولار ۱/۰) به گوده ها اضافه شد. برای کاهش اثرات متقابل پرتئین بالا در پلاسما نیز از محلول سولفات روی به میزان ۱۰cc استفاده شد. جهت استاندارد کردن دستگاه از NaNO2 استفاده شد. ابتدا ۴ نوع استاندارد با غلظتهای ۵μM و ۱۰μM و ۲۵μM و ۵۰μM تهیه و استفاده شد. منحنی استاندارد به دست آمده به صورت خط راست و قابل پذیرش بود. مجموع NO2+NO3 شاخصی برای میزان تولید NO در نظر گرفته شد. داده های به دست آمده بوسیله تهیه جدول ANOVA و به کمک نرم افزار آماری SAS مورد بررسی قرار گرفت. اختلافهای معنی دار بین گروههای بوسیله آزمون دانکن در سطح (0.05≤p)بررسی شد.
نتایج به دست آمده نشان داد:
میزان نیتریک اکساید تولیدی با آلوده شدن مرغان به سیست توکسوپلاسما افزایش می یابد.این افزایش تولید در هنگامیکه تعداد سیست ۵۰ عدد باشد در ۴ روز پس از تزریق انگل نسبت به سایر تیمارها کاملا معنی دار است (P≤0.05). افزایش روند تولید NO در تیمار چهارم تا روز هشتم ادامه یافت. اما ۱۲ روز پس از تزریق ، مقدار تولید NO در این گروه کاهش یافت. در سایر تیمارها افزایش محسوس تولید NO دیده شد. میزان تولید NO در تیمار سوم (۳۰ سیست تزریقی)، ۸ روز پس از تزریق ، نسبت به گروه اول و دوم تفاوت معنی داری را نشان داد و به مراتب بیشتر از آنها بود.این تیمار در روز ۱۲ پس از تزریق انگلها همچنان رو به افزایش بود. تحقیقات قبلی نشان داده است که پستانداران در عفونتهای داخل سلولی مقدار زیادی نیتریک اکساید تولید می کنند. مهمترین منبع ترشحی NO در آنها ماکروفاژها می باشند. اما تحقیقات زیادی در مورد پرندگان انجام نشده است. فعالیت آنزیم سنتز کننده NO و بیان mRNA مربوط به آن در ماکروفاژ طیور در سال ۱۹۹۷ گزارش شد. اما اشاره ای به عفونتهای داخل ماکروفاژها و میزان تولید NO نشده است. در سال ۱۹۹۹ به توانایی ماکروفاژهای( HD11 ) مرغان جهت تولید NO تاکید ورزید و اشاره نمود تبدیل شدن ال سیترولین به ال آرژنین در این دسته از ماکروفاژها رخ می دهد و منجر به تولید نیتریک اکساید می شود. Allen در سال ۱۹۹۷ مشخص نمود نیتریک اکساید در زمان آلودگی جوجه ها به Eimeria tenella افزایش می یابد. توکسوپلاسما پس از ورود به بدن توسط ماکروفاژها بلعیده می شود. بنابراین سلولهای Tسایتولیتیک، توانایی از بین بردن آنرا ندارد . در پستانداران مشخص شده است ، iNOS به عنوان آنزیم سنتز کننده NO توانایی ظهور در شرایط حاد دفاع ایمنولوژیک را ندارد. به عبارتی iNOS تنها در عفونتهای مزمن واجد اهمیت است. نتایج این تحقیق نیز چنین موضوعی را در مورد ماکیان تایید می کند. ایجاد شرایط مزمن بیماری(با حداکثر ۵۰ سیست) میزان تولید NO را افزایش داد. اما هنگامیکه بیماری از لحاظ کلینیکی علایم خود را بروز داد و شرایط حاد را در پیش گرفت (تیمار چهارم) میزان تولید NO کاهش یافت. که این خود موید کاهش فعالیت iNOS در این دسته از مرغان بود. در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد، همانند پستانداران سیستم ایمنی مرغان توانایی تولید نیتریک اکساید را دارد و از NO علاوه بر یک میانجی فیزیولوژیک ، به عنوان ترکیب ایمنولوژیک نیز بهره برداری می شود. پیشنهاد می شود در نژادهای بومی مرغان ایرانی و در شرایط In Vitro میزان تولید NO توسط ماکروفاژهای آنان بررسی و با سایر مرغان مقایسه گردد.
