معرفي انواع نشانگرهاي DNA
تاریخچه RFLP *
RFLP**** اولین* بار در سال* 1974 به* عنوان* یك* ماركر ژنتیكی* توسطGrodzicker *و همكاران برای* تعیین* جهش* در ویروس* به* كار گرفته* شد. استفاده* ازRFLPبه* عنوان* ماركر بیماری* ژنتیكی*اولین* بار توسطKon *و Dozy (1974) برای* آنالیز بیماری* كم* خونی* داسی* شكل* به* كار گرفته* شد.Botstein و همكاران* 1980تئوری* پایه* این* روش* را برای* نقشه*یابی* ژنهای* مرتبط* با بیماری* درانسان* مطرح* كردند. Southern روش* انتقال* الگویDNA *و پروب* (كاوشگر) از ژل* به*غشاء نیتروسلولزی* درRFLPرا ابداع* كرد.
Backman**** (1986) برای* اولین* بار استفاده* از این* نشانگر را مطرح* نمود. كاربردهای* مهم همچون* نقشه*یابی* و دستكاری* مكانهای* ژنهای* كنترل* كننده* صفات* كمی* با استفاده* ازRFLPدر سال*1983 توسطBackman* وSoller بیان* گردید. با گسترش* كاربرد این* نشانگر قدرتمند چند ژن* یا ژنوم*آنالیز شدند تعدادی* از گونه*های* دام* چون* گاو، گوسفند، بز، اسب، خوك* و جوجه* نیز با استفاده* از این*نشانگر آنالیز شدند
كلیات* تكنیك*
****مشخص* شده* است* كه* ژنوم* موجودات* به* طور طبیعی* دارای* تفاوتهائی* در ردیف* بازهای* خطی می*باشند این* تغییرات* طبیعی* كه* سبب* گوناگونی* در افراد یك* جمعیت* می*شود چند شكلی* ژنتیكی*نام* دارد. اگر این* چند شكلی* در ردیف* بازهایDNA *در جایگاه* شناسائی* آنزیم* محدودكننده* ایجادشده* باشند به* راحتی* قابل* ردیابی* استRFLP . وجود الگوهای* غیریكسان* است* كه* بر اثر هضم*آنزیمی* یك* ناحیهِ خاص* ازDNA بوسیلهِ آنزیمهای* محدود كننده* مشخص* می*شود. این* الگوهای*غیریكسان* به* علت* تفاوتDNA *بسته* به* حضور یا عدم* حضور جایگاه* آنزیمهای* محدود كننده*بوجود می*آید این* الگوها را به* دو شكل* می*توان* مشخص* كرد .
- هضم* آنزیمی* و سپس* الكتروفوز و استفاده* از لكه*گذاری* سادرن*
PCR فطعه* مورد نظر و هضم* آنزیمیRFLP**** مستقیما روی* تظاهر ژن* از طریق* تغییر در شكل*گیریmRNA *و میزان* و تعداد نسخه*برداری* تاثیر می*گذارد.
آنزیمهای* محدودگر
****آنزیمهای* برشی* دسته*ای* از آنزیمهای* آندو نوكلئاز به* شمار می*روند كه* یك* ردیف* اختصاصی از بازها را در درون* مولكولDNA *دو رشته*ای* شناسائی* می*كنند .
****در سال* 1970 سویه*های* معینی* از باكتری* كه* قادرندDNA خارجی* را كه* وارد سلول* آن شده* تجزیه* كنند، كشف* گردید. چون* با این* آنزیمها، سویه*های* ویژه*ای* از باكتری* قادر بودند كه* آلوده*كنندگی* فاژ یا ویروس* را كاهش* دهند و در واقع* زمان* میزبانی* باكتری* را محدود كنند به* اسم* آنزیم*محدودگر نامیده* می*شذتد. به* دلیل* اهمیت* این* پدیده* و نقش* كلیدی* آن* در پیشرفت* ملكولی* كاشفین*این* آنزیمهای* محدودگر سه* نفر به* اسم* آلبر(Albet) )، اسمیتSmith)) *)، ناتنز (Nathan)بودند كه* موفق* به* دریافت* جایزهِ نوبل* شدند ****در بیشتر مواقع* توالی* شناخته* شده* این* آنزیمها یك* پالیندروم* است* كه* معمولاإ شامل* چهار شش* جفت* باز دارای* تقارن* دو طرفی* است، یعنی* از چپ* و راست* به* یك* صورت* خوانده* می*شود.
****زمانی* كه* یك* آنزیم* برشی* بهDNA *اضافه* می*شودDNA از بسیاری* از مكانها كه* از آنها قبلاعنوان* سایت* برشی* یاد شد، شكاف* برمی*دارد و در اصط*لاح* هضم* می*شود. حاصل* فرآیند هضم،تعدادی* قطعه* است،
در زیر چند مثال* از آنزیمهای* برشی* آورده* شده* است:
****در روشRFLP *ابتدا نمونه*ای* ازDNAرا با یكنوع* آنزیم* برشی، هضم* می*كنند كه* در نتیجه تعداد زیادی* قطعه* با طول* متفاوت* بدست* می*آید، سپس* این* قطعات* با استفاده* از ژل* آگارز ازهمدیگر جدا می*شوند شناسائی* وتشخیص* یك* قطعه*خاص* با استفاده* از كاوشگرها امكانپذیر است*كه* این* عمل* با استفاده* از تكنیك* دیگری* تحت* عنوان* لكه*گذاری* سادرن* صورت* می*گیرد.
پروب* یا كاوشگر
****قطعهِ خاصی* ازDNAرا كه* متعلق* به* توالی* از یك* ژن* خاص* یاcDNA می*باشد، بوسیله آنزیمهای* برشی* خاص* هضم* و قطعات* حاصل* در حاملهایی* (پلاسمید) كه* توسط* همان* آنزیم*محدودگر برش* داده* شده*اند جاگذاری* می*شود. این* پلاسمیدها جهت* تكثیر و نگهداری* به* باكتریهای*آزمایشگاهی* كه* اغلب* اشریشا كلی* هستند منتقل* می*شوند. كلونهای* یاد شده* توسط* رادیو ایزوتوپها یامواد شیمیایی* چون* بیوتین* نشاندار می*شود. در صورت* وجود همگنی* ردیف* بازی* مشابه* بین* پروب*وDNA هضم* شده* اتصال* بین* این* دو برقرار خواهد گردید.
لكه*گذاریSouthern** *
****برای* انجام* عمل* هیبرایداسیون* لازم* است* كه* علاوه* بر قطعه* كاوشگر، قطعاتDNA *هضم شده* نیز تك* رشته*ای* شوند لذا ابتداDNA روی* ژل* آگارز كه* حاوی* قطعات* هضم* شده* است* درمحلولهای* قلیائی* مثل* اوره* یا فرمالدئید یا هیدروكسیدسدیم* تك*رشته* می*نمایند. سپس* صفحه*ای* ازغشاء نیترو سلولزی* را روی* قسمت* فوقانی* ژل* قرار داده* و روی* آن* غشاء مقداری* كاغذ جاذبه* الرطوبه*می*گذارند محلول* بافر تانك* الكتروفوزر بوسیله* فشار اسمزی* كاغذ فوقانی* بالا كشیده* می*شود و حین*عبور از ژل* به* غشاء نیترو سلولزی* كه* دارای* بار مثبت* است* منتقل* می*گردد. با تسهیل* عمل*هیبریداسیون* بین* كاوشكر و قطعاتDNA *هضم* شده* در معرض* پروب* نشاندار رادیواكتیو در نقاطی*كه* همولوژی* وجود دارد هیبرید می*گردد. قطعاتی* كه* هیبریداسیون* در آنها صورت* نگرفته* است* ازمحیط* شسته* می*شوند و سپس* از غشای* نیترو سلولزی* در مجاورت* فیلم* عكاسی* اتورادیوگرافی*بعمل* می*آید پس* از ظهور و ثبوت* فیلم* قطعات* ویژه*ای* ازDNA كه* با پروب* هیبرید هستند به*صورت* یك* باند مرئی* دیده* می*شود شكل* زیر مراحل* انجام* لكه*گذاریSouthern *را نشان* می*دهد.
مزایایRFLP *عبارت* است* از موارد زیر می*باشد:
- تحت* تاءثیر محیط* نیست* و صددرصد ژنتیكی* است*
- همبارز است*
- تكرار پذیری* آن* بالاست*
PCR-RFLP(PBR)
****در روش* دومRFLP *، ابتدا قطعه* حاوی* جایگاه* چند شكلی* را با واكنش* زنجیرهِ پلی*مراز واستفاده* از دو پرایمر مخصوص* كه* به* همین* منظور طراحی* شده* تكثیر می*نمایند و پس* از هضم*آنزیمی، الكتروفوز می*كنند. درPBR جهشهائی* از نوع* نقطه*ای* و حذف* و اضافه* كه* باعث* تغییر درسطح* قطعه* آنزیمی* می*گردند قابل* تشخیص* است*
**فرق* لكه*گذاری* سادرن* وPBR
****در RFLPسادرن* تنوعDNA*در داخل* یك* منطقهKb *30 محصور توسط* پروب* تعیین می*گردد در حالیكه* درPBR تنوع* در داخل* منطقه*ای* كه* از دو طرف* به* پرایمر ختم* شده* تعیین*می*شود این* ناحیه* معمولاKb2-0.5است. علاوه* بر این* درPBRمزایائی* چون* سادگی، سرعت*زیاد، عدم* نیاز به* مواد رادیواكتیو و تكرارپذیری* بالا مطرح* می*باشد
****میزان* پلی*مورفیسم* و تعداد آللها درPBR كمترازRFLPسادرن* می*باشد عباسی* (1376)نشانگرPBRبرای* تشخیص* پلی*مورفیسم* در ژن* هورمون* رشد گاوهای* هلشتاین* استفاده*كرد Aggrey****و همكاران* (1999) از ماركرPBR برای* تشخیص* پلی* مورفیسم* در ناحیهِ مجاور ژن* گیرنده* هورمون* رشد در گاوهای* هلشتاین* كانادا استفاده* نمودند و الگوهای* باندی* مختلفی* را درروی* ژل* مشخص* نمودند
PCR-SSCP
****این* روش* در سال* 9891 ابداع* شد. زمانی* كهDNA*دو رشته*ای* در روی* ژل* الكتروفوز حركت داده* می*شود. حركتDNA *به* اندازه* قطعه* بستگی* دارد بطوریكه* مولكولهای* كوچك* از منافذ ژل* به*آسانی* عبور می*كنند. در الكتروفوزSSCPابتدا از یك* مادهِ دناتوره* كننده* (واسرشت* كننده) مانند اوره*برای* تبدیلDNA *دو رشته*ای* به* تك* رشته*ای* استفاده* می*شود.
****در هنگام* راندنDNA *تك* رشته* در ژل، اثر متقابل* داخل* مولكولی* روی* می*دهد. به* عبارت دیگرDNA رشته* قادر است* در بخشهائی* با خود باند تشكیل* دهد بنابراین* حركت* مولكولها دراین* حالت* بیشتر به* ساختار مولكولیDNA* تك* رشته* نیز وابسته* است* (ساختمان* سوم)
****ساختمان* سوم* در قطعه* تك* رشته* وابسته* به* توالی* كل* قطعه* است* اگر جهش* در توالیA *رخ* دهد ساختار قطعه* تغییر می*یابد. اگر پلی* مورفیسم* در قسمت* آغازین* محصولPCR *باشدشناسائی* آن* باSSCP بسیار راحت*تر است.
PCR-DGGE
DGGE**** یكی* از روشهای* مناسب* برای* آشكار سازی* جهشها است. این* روش* بررسی فرآورده*های* زنجیره* پلی*مراز صورت* می*گیرد. در صورتیكه* قطعات* رشتهDNA *در یك* نوكلئوتید باهم* متفاوت* باشند، الگوی* واسرشت* شده* متفاوتی* را نشان* می*دهند. در این* روش* دو نمونهDNA *دردو ستون* جداگانه* از یك* ژل* پلی*اكریلامید كه* دارای* نسبتی* از غلظت* ماده* واسرشت* كننده* (معمولافرمامید) است، مورد الكتروفورز قرار می*گیرد. وقتی* مولكولها به* سطح* بحرانی* دناتوره* می*رسند، دورشتهDNA *شروع* به* جدا شدن* می*كنند در این* حالت* كاهش* معنی*داری* در حركت* قطعات* ایجادمی*شود. این* نقطه* به* عنوان* نقطه* ذوب* عمل* می*كند و باعث* تاءخیر در حركت* مولكولDNA *جهش*یافته* نسبت* به* فرم* وحشی* می*گردد
DGGE**** به* مواد رادیواكتیو و مواد شیمیائی* سمی* احتیاج* ندارد ولی* ابزار پیشرفته*می*خواهد درصد تعیین* موتاسیون* در این* روش* خیلی* نزدیك* به* 100% است. نوع* مشابه*ای* از این*روشTGGEمی*باشد كه* در آن* از حرارت* بجای* غلظت* مواد شیمیائی* در ژل* استفاده* می*شود. شكلهای* پیوست* چگونگی* انجام* تكنیكDGGE *را نشان* می*دهد.****بهترین* طول* قطعات* برایDGGE *بینbp *150-1500می*باشد. برای* واسرشت* شدن* كامل قطعات* حاصل* از زنجیرهِ پلی*مراز از یك* ناحیه* حاوی* بالاترین* دمای* ذوب* مصنوعی* به* نام*GC-clamp استفاده* می*شود نمونه*ای* از استفاده* از ماركرDGGEرای* یافتن* پلی* مورفیسم* دراگزون* ده* گیرندهِ هورمون* رشد توسط* جیGe و همكاران* (1999) انجام* شده* است*
PCR-ARMS
****روشARMS *روش* سریعی* برای* تعیین* جهشهای* نقطه*ای* و حذف* و اضافه*ها است. این* روش* اولین* بار توسطNewton *و)Groham 1994 (برای* آنالیز بازهای* متفاوت* دروالدین* حاوی* كمبود آنتی*ترپیسین* و همچنین* برای* تشخیص* والدین* ناقل* بیماری* سیستیك*فیبروزیس* و بتاتالاسمی* بكار گرفته* شد.
****این* تكنیك* براساس* طراحی* پرایمرهای* اختصاصی* آللها درPCRمی*باشد. برای* تشخیص یك* جهش* ویژه، دو پرایمر كنترل* در نزدیكی* محل* موتاسیون* برای* اطمینان* از عمل* صحیحPCR *طراحی* می*شود. برای* تكثیر منطقهِ حاوی* جهش* نیز یك* پرایمر مشترك* برای* الل* موتانت* و وحشی*طراحی*می*گردد. دو پرایمر باقی* مانده* همان* پرایمرهایARMS* می*باشد كه* باز َ3 آنها به*ترتیب* مكمل* توالی* الل* موتانت* و الل* وحشی* هستند. چنانچه* پرایمرARMSدارای* َ3 مكملDNA *الگو بود، همراه* با پرایمر مشترك* قطعه* ما بین* دو پرایمر تكثیر می*گردد و ما در روی* ژل* دو باند رامشاهده* می*نمائیم.
****اگر پرایمرARMSدارای* َ3 مكملDNA *الگو نبود، فقط* یك* باند در روی* ژل* كه* حاصل* تكثیرمنطقه* بین* دو پرایمر كنترل* می*باشد، مشاهده* می*گردد. زیرا انتهای* َ3 ناجور جفت* شدگی* دارد وباعث* جلوگیری* از عمل* پلی* مراز به* جهت* دور شدن* َ3 آغازگر ازDNA می*شود آقائی*(1376) اولین* بار در ایران* از این* نشانگر برای* شناسائی* جهشهای* ژن* كاپاكازئین* در گاوهای* بومی*ایران* استفاده* نمودند
AFLP
Zabeau**** و همكاران* (1993) روش* جدیدی* را تحت* عنوان* تكثیر قطعات* برش* یافتهِ انتخاب ابداع* كردند كه* حاصل* آنAFLP *است. این* روش* تركیبی* ازPCR وRFLPمی*باشد. درسال*1995،Vosو همكاران* از این* روش* برای* انگشت* نگاری* ژنومهائی* كه* از لحاظ* چند شكلی* در طول*قطعات* حاصل* از هضم، بسیار بهم* نزدیك* بودند استفاده* نمودند
مزایایAFLP *
نیاز به* پروب* ندارد
دمای* اتصال* پرایمر به* الگو بسیار بالاست*
معمولا غالب* است* و زمانی* همبارز است* كه* سایت* برشی* پلی* مورفیك* كاملا داخل* قطعه*باشد
ریزماهواره*ها
****واژه* ریزماهوار در سال* 1985 بوسیلهJeffery *مطرح* گردید و مفهوم* آن* توالیهای* كوتاه* تكرارشونده* در ژنوم* موجودات* می*باشد. ریزماهواره*ها توزیع* وسیعی* را در اكثر گونه*های* مهره*داران* به*خود اختصاص* داده*اند معمولترین* تكرارها در ژنوم* پستانداران، تكرارهای* دو نوكلئوتیدی*CA)n و(CT)n وdG - dT)n ) می*باشد.
****تعداد باز موجود در هر ردیف* تكرار شونده* ممكن* است* دو، سه، چهار یا حتی* بیشتر با برای* طراحی* پرایمر از خود این* نوكلئوتیدهای* تكراری* استفاده* می*شود.
****كاربرد میكروساتلیتها به* عنوان* آغازگر اولین* بار توسط* لیكفدت* و همكاران* بحث* شده* است چون* میكروساتلیت*ها چند شكلی* بالائی* دارند می*توانند به* آسانی* درPCRردیابی* شوند. ****نقشه*یابی* ژن* با این* ماركر در گونه*هائی* مانند گاو كه* بیش* از 400میكروساتلیت* شناخته* شدهدارد، سریعتر صورت* خواهد گرفت* **در حالی* كه* هر دو الل* یك* مكان* ژنی* را می*توان* باRFLPمورد تجزیه* قرار داد، در میكروساتلیت*بندرت* می*توان* تعیین* كرد یك* قطعه* خاص* در حالت* هموزیگوت* یا هتروزیگوت* بوجود آمده* است.
از میكروساتلیت* برای* كشف* اشتباهات* موجود در ثبت* والدین* برای* نتاج* در مراكز اصلاح* نژاداستفاده* می*شود و در پیش*بینی* ارزشها اصلاحی* بكار گرفته* می*شود. بعضی* از مشكلات* استفاده* ازماهواركها به* شرح* زیر است.
****عملیات* شناسائی* ریز ماهواره*ها، تعیین* توالی* بازی* آنها و طراحی* و ساخت* آغازگرها
تهیه* نقشه* ژنتیكی* بسیار پیچیده* بوده* و مستلزم* صرف* وقت* و هزینه* فوق*العاده* است.
****به* علت* پلی*مورفیسم* زیادتر از حد ریز ماهواره*ها كاربرد آنها فقط* در رده*بندی*های* درون گونه*ای* پیشنهاد می*گردد Lucy و همكاران* (1998) از این* ماركر برای* بررسی* پلی*مورفیسم* در ناحیه* پیش*بر(پروموتور) ژن* گیرندهِ هورمون* رشد استفاده* نمودند
STS وALP
****وجود اختلاف* در اندازهِ قطعات* حاصل* ازPCR كه* در آن* دو پرایمر هدفمند از توالی* ژن بكار رفته* است* راALP گویند. این* اختلاف* بیانگر وقوع* پدیده* حذف* یا اضافه* شدن* این* نشانگراست* كه* اولین* بار بوسیله Olson *(1989) مطرح* گردید.****برای* مشاهده* پلی* مورفیسم* از نوع* حذف* و اضافه* در ALP لازم* است* كه* حداقل* 10 جفت* بازدر این* نوع* جهش* شركت* داشته* باشند.
نشانگرRAPD
****در سال* 1990 دو گروه* تحقیقاتی* همزمان* روشی* را برای* سنجش* میزان* چند شكلی ابداع* كردند یك* گروه* در شركت* دوپونت كه* روش* خود راRAPD نامیدند و گروه* دیگر در موِسسه*تحقیقات* زیست* شناسی* كالیفرنیا كه* روش* خود را واكنش* زنجیرهِ پلی* مراز با پرایمر تصادفی*Arbitrarily Primed PCR نامیدند.****در این* روش* یك* آغازگر چند نوكلئوتیدی* كوتاه* كه* بطور تصادفی* از توالیهای* بازیA *انتخاب* شده* است* در مجاور سایر مواد لازم* برای* تكثیر درPCR قرار می*گیرد. در این* تكنیك* چندشكلی*هایDNA *یا از اختلافات* موجود در توالیDNA *در مكانهای* اتصال* آغازگر یا از طریق*دگرگونیهائی* كه* در اثر اضافه* شدن* و حذف* و انورسیون* در نواحی* تكثیر شده* روی* داده* است*مشاهده* می*گردد.******اگر مكانهای* اتصال* آغازگر روی* دو رشته* الگو، در فاصلهِ مناسبی* قرار گرفته* باشند،DNA پلیمراز قادر به* طی* كردن* فاصله* دو پرایمر اتصالی* خواهد بود. در این* روش* بطور كلی* ازآغازگرهائی* با طول* 9-10نوكلئوتید با حداقل* محتوای* 50 GC%استفاده* می*شود.
****ماركرRAPDیك* ماركر غالب* است* و در آن* ژنوتیپ* افراد هتروزیگوت* رانمی*توان* تشخیص داد. این* مسئله* باعث* كم* ارزش* شدن* آن* درF2شده* است* ****كاربردRAPDدرگونه*های پستاندار محدوداست* وكمتر درمطالعات* حیوانی* استفاده* می*شودعلاوه*بر غالبیت، دمای* اتصال* پایین* به* علت* كوتاهی* پرایمرها احتمال* وقوع* اتصالات* اشتباهی* را بالامی*برد. میرحسینی* و همكاران* (1374) از ماركرRAPDبرای* تعیین* چند شكلی* در لاین*های* كرم*ابریشم* ایران* استفاده*نمود
****آزادی* (1378) با استفاده* از این* ماركر فاصله* ژنتیكی* پنج* نژاد گوسفند ایرانی* را بررسیكرد (3). ولی*الهی* و همكاران* (1379) ازماركرRAPD اولین* بار برای* مطالعه* گونه*ای* برخی* باربوس*ماهیان* ایران* استفاده* نمودند
DAF
****در سال* 1991 این* تكنیك* توسطCaetano-Anolles *پیشنهاد شده* است. این* نشانگر از نظراصول* مشابه* با روشRAPD *می*باشد و تفاوتهای* آن* با روشRAPD *در طول* آغازگر، سیكل*حرارت* مورد استفاده* درPCR ، نوع* ژل* و رنگ* آمیزی* می*باشد.
SCAR
Michelmore**** و همكاران* (1993) نوع* جدیدی* از نشانگرهای* مولكولی* را كه* از روش RAPD مشتق* شده* بود و مشكلات* مربوط* به* آنها را نداشت* ابداع* نمودند.****در این* روش* قطعات* حاصل* ازRAPDرا كلون* و تعیین* توالی* می*كنند و در مرحله* بعد آغاز24وكلئوتیدی* را كه* مكمل* انتهای* قطعهِ توالی* یابی* شده* می*باشد را طراحی* می*نمایند. وقتی* این*آغازگر باDNA الگوی* اصلی* درPCRبه* كار رود یك* مقرر ژنی* كه* اصط*لاحاإ اسكار(SCAR)نامیده*می*شود تكثیر می*شود
منبع: آرش جوانمرد. بررسی چند شکلی ناحیه پروموتور ژن گیرنده هورمون رشد در گاوهای سیستانی. پایان نامه کارشناسی ارشد- دانشگاه تهران
