” واکنش زنجیره ی پلیمراز “
اين تکنِِيک در اواسط دهه ی ۱۹۸۰ بوسيله ی کری موليس معرفی شد . به دليل کاربردها و مزيت های بسيار زياد آن به سرعت در زيست شناسی مولکولی گسترش پيدا کرد . امروزه اين روش تقريباً در تمامی آزمايشگاهها ی زيست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتيک بوسيله ی کامپيوتر انجام می شود.
اين تکنيک تمامی مشکلات قبلی در زيست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادير زياد از DNA يکسان بود را برطرف کرد . برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخه های متعدد از يک ژن خاص می بايست اين
ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در يک باکتری تکثير کنند ولی امروزه اين کار را به سادگی و با استفاده از PCR انجام می دهند.
PCR از نظر اصول عملی تشابه زيادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است . ياد آوری می شود که DNA پليمراز DNA تک رشته ای را از جهت
۵َ ۳َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد ورشته مکمل را در جهت ۳َ ۵َ
می سازد . همچنين DNA پليمراز برای شروع احتياج به يک قطعه اوليه ( شناساگر ) دارد .
برای انجام PCR ، DNA پليمراز ، نوکلئوتيد تری فسفات ها و پرايمر لازم هستند . از آنجائيکه DNA دو رشته ای است ، دو نوع پرايمر در PCR مورد نياز است . اين دو پرايمر دو عمل انجام می دهند ، اول اينکه محل ژنی که بايد تکثير شود را مشخص می نمايند و دوم اينکه اندازه ی قطعات تکثير شونده را تعيين می کنند . عمل اول کاملاَ مشخص است ، در مورد عمل دوم بايد گفت که وقتی اين دو شناساگر به دو ناحيه ی مختلف DNA و به سمت هم قرار می گيرند DNA پليمراز تنها قطعات را در بين اين دو ناحيه همانند سازی می کند و به اين ترتيب طول قطعات ساخته شده تعيين می شود .
برای شروع PCR ، DNA الگو ، پرايمر ها و نوکلئوتيد تری فسفات ها و DNA پليمراز در يک لوله با هم مخلوط می شوند . سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند . سپس لوله را سرد می کنند تا پرايمر ها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNA پليمراز شروع به همانند سازی از روی DNA بنمايد . بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار ديگر پرايمر ها به نواحی مکمل خود متصل شوند . چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحيه مورد نظر مضاعف شده است ، در اين مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد و در نتيجه در پايان اين مرحله بوجود مي آيد ، و در مرحله ی بعد ۱۶ نسخه و به همين صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زياد می شود .
در ابتدای طراحی PCR از آنزيم DNA پليمراز E.coli استفاده شد ولی اين آنزيم به حرارت حساس می باشد و بنابراين پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دمای ۹۴ درجه ی سانتی گراد ، افزودن دوباره ی آنزيم تازه به محيط لازم بود . يکی از مهم ترين کشفيات در اين زمينه اين بود که باکتريهای چشمه های آب گرم دارای DNA پليمراز هايی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعاليت بهتری دارند . برای مثال باکتری Thermus aquaticus دارای DNA پليمرازی است که در دمای ۹۴ درجه ی سانتی گراد کاملاَ پايدار است و همچنين دمای اپتيمم عمل آن نيز ۷۲ درجه ی سانتی گراد می باشد ، اين DNA پليمراز که بطور خلاصه Taq پليمراز ناميده می شود باعث شد که براحتی PCR به صورت اتوماتيک انجام شود و با افزودن يکبار آنزيم Taq پليمراز ديگر نيازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد .
مزيت بسيار مهم ديگر Taq پليمراز افزايش حساسيت و دقت PCR می باشد . در دمای پايين ( ۳۰ درجه سانتی گراد ) ( که برای DNA پليمراز E.coli بکار می رفت ) پرايمر ها ممکن است به جايگاههايی که توالی تا حدودی مشابه دارند نيز متصل شوند ، زيرا در دمای پايين تعداد کمتری پيوند هيدروژنی برای اتصال پرايمر ها نياز است . بنابراين پرايمر ها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه ، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می شوند . ولی وقتی که واکنش در دمای ۷۲ درجه ( دمای اپتيمم فعاليت Taq پليمراز ) انجام شود اتصال پرايمر ها به نواحی غير از ناحِيه ی اصلی کاهش می يابد . به اين صورت پس از پايان PCR رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد .
برای ديدن قطعات تکثير شده DNA می توان براحتی از الکتروفورز برای ژل آگاروز و رنگاميزی اتيديوم برومايد استفاده کرد .
کاربردهای PCR :
تکنيک PCR کاربردهای نا محدودی در عرصه های مختلف زيست مولکولی دارد ، علت اصلی اين امر اين است که DNA الگوی بکار رفته در PCR را می توان از منابع مختلف تامين کرده و مورد استفاده قرار داد .
بطور کلی PCR به دو منظور اصلی بکار می رود :
۱ – تهيه ی نسخه های متعدد از يک ژن
۲ – بررسی حضور يا عدم حضور يک ژن خاص در يک قطعه DNA
· تهيه ی نسخه های متعدد از يک ژن :
برای اين کار بجای اينکه هر دو پرايمر مورد نياز برای PCR را به يک ميزان به محيط واکنش اضافه کنند ، يکی از پرايمر ها را به تعداد کمتر پرايمر ديگر را به تعداد بيشتر اضافه می کنند . در هنگام انجام PCR ، در ابتدا هر دو رشته با هم همانند سازی می کنند ولی پس از تمام شدن يکی از پرايمر ها فقط رشته ديگر که هنوز پرايمر آن وجود دارد ساخته می شود و به همين دليل نسخه های بيشتری از اين رشته بوجود می آيد. پس از پايان PCR چند نسخه DNA دو رشته ای از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد که می توان به طور مستقيم در روش سانجر بکار برد .
مثال ديگری از کاربردهای PCR بررسی پيوستگی ژنها و تعيين فاصله ی بين ژنها بر روی کروموزومهای انسان است . در ژنتيک برای تعيين فاصله ی بين ژنها از بررسی تعداد نوترکيبها به نسبت فنوتيپ والدين استفاده می شود . اين روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسيار زياد و دوره ی رشد آن نيز کوتاه است به راحتی قابل انجام است ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسيار محدود و با فاصله ی زمانی زياد می باشد ، اين بررسی هابه سختی و با محدوديت بسيار انجام می گيرد . ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCR روش جديدی را برای اين کار پيدا کرده اند . برای اين کار از بررسی آللهای موجود در يک اسپرم استفاده می شود . از آنجائيکه اسپرمها هاپلوئيد بوده و در هر اسپرم از هر کروموزوم يک عدد وجود دارد ، با بررسی همزمان دو ژن بر روی يک کروموزوم و تعيين ميزان نوترکيبی بين اين دو ژن می توان فاصله ی ژنتيکی بين دو ژن را تعيين کرد . در واقع از نظر ژنتيکی بررسی ۱۰۰۰ اسپرم با بررسی ۱۰۰۰ فرزند يک خانواده برابر است . با استفاده از اين روش ثابت شده است که ميزان نوترکيبی کروموزومها در مردها با ميزان نوترکيبی در زنها متفاوت است .
بررسی حضور يا عدم حضور يک ژن خاص در مخلوطی از DNA :
به جرات می توان گفت که اين کاربرد دوم PCR مهمترين کاربرد آن و علت اصلی
گسترش روزافزون آن در کليه ی شاخه های علوم زيست مولکولی است . تعدادی از اين کاربردها عبارتند از :
الف ) تشخيص قبل از تولد بيماريهای ژنتيکی :
در اين روش تعدادی از سلولهای جنين را استخراج کرده و با پرايمر اختصاصی برای يک ژن بيماری مجاور مي کنند ، همچنين بطور جداگانه با پرايمر ژن سالم نيز مجاور می کنند و PCR انجام می دهند . پس از پايان PCR تفسير آزمايش چنين خواهد بود : اگر در هردو لوله سنتز DNA انجام شود ، جنين يک ژن سالم و يک ژن بيمار دارد يعنی حامل است ولی بيمار نيست . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که شناساگر مخصوص ژن بيمار وجود دارد انجام شود جنين بيمار است و بايد سقط شود . اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام شود ، جنين کاملاَ سالم است .
امروزه بسياری از بيماريهای ژنتيکی مانند هموفيلی ، کم خونی داسی شکل ، سيستيک فيبروزيز (Cystic Fibrosis ) ، تالاسمی ، سندرم لش – نيهان ، ديستروفی عضلانی دوشن ، فاويسم ، فنيل کتون اوری و غيره را می توان به کمک PCR تشخيص داد.
ب ) تعيين جنسيت جنين :
برای اين کار تعدادی از تخمک های زن را خارج مي کنند و در شرايط آزمايشگاهی با اسپرمها آميزش می دهند و هر يک از سلولهای تخم تشکيل شده را بطور جداگانه کشت می دهند تا اينکه جنين به مرحله ی ۱۰ سلولی برسد . سپس از هر جنين يک سلول را جدا کرده و همراه با پرايمرهای اختصاصی برای کروموزوم y در لوله PCR وارد می کنند.سپس PCR و در پايان الکتروفورز انجام می شود . در هر يک از لوله ها که جنين نر ( يعنی کروموزوم y ) وجود داشته باشد ، سنتز DNA صورت می گيرد و در لوله ی ديگر نه . حال جنسيت تمامی جنين ها مشخص می باشد و می توان به اختيار خود پسر يا دختر را انتخاب کرده و جنين مورد نطر را به مادر انتقال داد . امروزه تکنيک فوق علاوه بر تعيين جنسيت برای خانواده هايی که در معرض خطر بيماريهای وابسطه به X ( مانند هموفيلی ) هستند نيز استفاده می شود . به اين صورت که جنين ها ی اوليه را از نظر وجود ژن بيمار با استفاده از پرايمر اختصاصی آن مورد بررسی قرار می دهند و جنين سالم را به مادر منتقل می کنند .
شايد باورنکردنی باشد که تمامی مراحل بالا يعنی استخراج تخمک از مادر ، لقاح ، تکثير ، PCR و انتقال مجدد به مادر در مدت زمان يک روز قابل انجام است .
راه ديگر تعيين جنسيت جنين استفاده از خون مادر است . در طی دوران بارداری مقداری از سلولهای جنين وارد خون مادر می شوند . حال اگر PCR برای قطعه ی DYZl ( در حدود ۵۰۰۰ نسخه از اين قطعه بر روی کروموزوم y قرار دارد ) بر روی خون مادر انجام شود و جواب مثبت باشد چون مادر کروموزوم y ندارد پس اين ژن مربوط به کروموزوم y جنين است و جنس جنين نر تعيين می شود .
بررسی عفونت های باکتريايی و ويروسی :
هم اکنون در بعضی از آزمايشگاهها از PCR برای تشخيص ايدز استفاده می کنند. برای اين کار از خون محيطی نمونه گيری می کنند و از توالی های اختصاصی ويروس HIV نيز به عنوان شناساگر استفاده می کنند ، سنتز DNA نشان دهنده ی عفونت ايدز است.
استفاده ديگر PCR در تشخيص بيماری سل می باشد . مايکوباکتريوم توبرکلوزيس يک باکتری بسيار کند رشد است و رشد معمولی آن در آزمايشگاه حدود ۲۰ روز طول می کشد. در PCR بيماری سل از نمونه ی خلط فرد بيمار به همراه پرايمرهايی که برای توالی خاص مايکوباکتريومهای مکمل می باشند ، مورد استفاده قرار می گيرد . پس از انجام PCR قطعات DNA بدست آمده در مجاورت شناساگرهای اختصاصی برای سوشهای مختلف مايکوباکتريومها قرار می گيرد و به اين صورت گونه و سوش آن تشخيص داده می شود .
تشخيص جهش ها و سرطان ها :
در هر سلول معمولاَ از يک ژن فقط يک نسخه وجود دارد ، و در صورتی که اين ژن دچار جهش شود بررسی اين جهش بسيار مشکل خواهد بود ، زيرا در سلولهای انسان پيدا کردن يک ژن در ميان کل ژنوم انسان ، همانند پيدا کردن سوزن در انبار کاه خواهد بود و پس از پيدا کردن ژن جهش يافته نيز به دليل محدوديت نسخه های اين ژن بررسی کميت و کيفيت جهش در آن مشکل خواد بود .
ولی امروزه PCR کار را بسيار راحت نموده است . کافی است که يک سالم و يک سلول جهش يافته بطور جداگانه برای يک ژن خاص تحت PCR قرار گيرند و محصولات حاصل با هم مقايسه شوند . به اين ترتيب به راحتی می توان محل جهش ، نوع جهش و هر نوع اطلاعات لازم ديگر را به دست آورد .
استفاده ديگر PCR در بررسی مراحل درمانی سرطان می باشد . داروهای مورد استفاده در درمان سرطان داروهای سيتوتوکسيک می باشد که عوارض جانبی بسيار زيادی به همراه دارند. به همين دليل نيز سرطان شناسان مايل اند که از مراحل بهبودی سرطان اطلاع داشته باشند تا به محض از بين رفتن سلول بدخيم درمان را متوقف نمايند ، ولی در صورتی که بهبودی کامل حاصل نشده باشد ، احتمال عود مجدد بيماری وجود خواهد داشت. با استفاده از PCR دقت تعيين سلولهای سرطانی بسيار بالا می رود که اهميت آن ناگفته پيداست و به همين دليل PCR منفی را می توان به معنای بهبودی کامل در نظر گرفت .
تعيين تواليهای کروموزومی انسان در سلولهای هيبريدی ( هتروکاريونها ) :
يکی از تکنيکهای بررسی ژنوم انسان ، تلفيق ( هيبريد کردن ) هسته های سلولهای انسانی با سلولهای حيوانات ديگر مثلاَ موش است . پس از انجام تلفيق دو هسته ، کروموزومهای انسان به تدريج حذف می شوند ، تا اينکه نهايتاَ يک کروموزوم در درون هسته هيبريدی باقی می ماند . حال گاهی به منظور بررسی های بيشتر لازم می شود که اين قسمتهای ژنوم انسان تکثير شوند ، مثلاَ وقتی که يک ژن خاص مورد بررسی قرار می گيرد . برای اين کار ازنوع خاصی از PCR که به Alu-PCR معروف است استفاده می شود.
در اين روش از پرايمرهايی استفاده می شود که مکمل تواليهای بسيار تکراری ژنوم ها می باشد ، اين توالی های ۳۰۰ جفت بازی که گاهی تا ۹۰۰۰۰۰ بار در ژنوم انسان و ديگر پستانداران تکرار می شود را تکرارهای Alu می نامند . اين توالی ها بسيار متغير می باشند ولی در انسان قسمتی از اين توالی ها اختصاصی و ثابت است و به همين دليل به راحتی می توان از آن برای تکثير قطعات DNA که بين دو تکرار توالی Alu قرار دارند استفاده کرد . سپس اين DNA را می توان خارج نمود و از نظر نوع پروتئين مورد سنتز و يا تعيين توالی و غيره مورد بررسی قرار داد . مهمترين استفاده روش فوق تعيين مکان ژنتيکی ژنهای مختلف برروی کروموزومهای انسان است که تا قبل از اين روش تقريباَ
نا ممکن ويا بسيار مشکل بود .
مشکلات PCR :
با تمامی مزيت های فوق PCR مشکلات خاص خود را دارد . مهمترين مشکل PCR آلودگی نمونه های مورد بررسی است . به دليل حساسيت فوق العاده و قدرت تکثير زياد PCR هر قطعه DNA خارجی که وارد محيط PCR شود ، مورد تکثير قرار گرفته و نتايج عجيب و دور از واقعيتی به وجود خواهد آورد . برای مثال در مورد تحقيقی که در تعيين جنسيت با استفاده از خون مادران باردار بيان شد ، در بين جوابها يک مورد مثبت کاذب برای يکی از زنان غير باردار که به عنوان شاهد منفی استفاده شده بود ، وجود داشت . پس از بررسی معلوم شد که تعداد ناچيزی از سلولهای پوست يکی از کارکنان مرد آزمايشگاه وارد لوله ی PCR شده است . گاهی نيز باقيمانده ی قطعات DNA حاصل از تکثير DNA های قبلی باعث آلودگی PCR می شود که در اين مورد شستشوی زياد و دقيق مشکل گشا است .
واکنش زنجيره ی پليمراز نسخه برداری معکوس : RT-PCR
واکنش زنجيره پليمراز نسخه برداری معکوس ( RT-PCR ) تعديلی از واکنش زنجيره پليمراز PCR ) ) برای تقويت اطلاعات محتوی اسيد ريبو نوکلئيک (RNA ) توسط تبديل آن به DNA و سپس تقويت آن می باشد . رشته ی RNA در ابتدا به صورت معکوس به مکمل DNA خود يا DNA مکمل نسخه برداری می شود و با تقويت DNA حاصله با استفاده از واکنش زنجيره پليمراز دنبال می گردد . اين می تواند يک فرآيند ۱ يا ۲ مرحله ای باشد .
واکنش زنجيره پليمراز خودش فرآيندی است که برای تقويت نمونه های DNA بکار می رود ، از طريق پليمراز DNA با واسطه ی حرارت .
PCR نسخه برداری معکوس نبايد با واکنش زنجيره پليمراز زمان واقعی که غالباَ به صورت RT-PCR خريد و فروش می شود ، اشتباه شود .
