مقایسه روشهای مختلف استخراج DNA برای ژنوتایپینگ دامها با نشانگرهای PCR-RAPD و PCR-RFLP
چكیده:
امروزه برای شناسائی جهشهای موجود در سطح ژنوم پستانداران می توان از تكنیكهای مختلفی همچون روشهای مبتی بر PCR از جمله Microsatellite، SSCP، AFLP، RFLP، DGGE و ARMS استفاده نمود. این تكنیكها عمدتا برای نقشه یابی ژنها، تشخیص ژنوتیپهای مختلف یك ژن مطلوب و همچینین مطالعات جمعیتی و آزمون انساب استفاده می شود. مزیت انكارناپذیر این تكنیكها، تجریه و تحلیل سریع اطلاعات ژنوم در یك جمعیت با استفاده از مقادیر بسیار ناچیزی از DNA می باشد. بنابراین در قدم اول نیاز به استفاده از یك روش استخراج DNA كه سریع و بی خطر و مقرون به صرفه باشد، همواره احساس می شود. چندین روش مختلف به منظور حداقل كردن مراحل استخراج DNA ، توسط محققان مختلف گزارش شده است. در این تحقیق اقدام به مقایسه روشهای مختلف استخراج DNA از خون، شیر، ریشه مو، اسپرم گردید. كیفیت و كمیت استخراج با دو روش اسپكتوفتومتری و ژل مونتیورینگ مشخص شد. و در نهایت برای ارزیابی كیفیت DNA استخراج شده ، انجام تكنیكهای (RAPD) با استفاده از آغازگر تصادفیOPU۱۳ و RFLP با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ۲۴ جفت بازی طراحی شده برای تكثیر ۴۲۲ جفت باز از اینترون دو ژن لپتین و با استفاده ازآنزیم برشی Sau۳AI، صورت پذیرفت. در نهایت روش سیلیكا ژل روشی منلسب، مقرون صرفه برای استخراجDNA برای سلولهای مختلف پیشنهاد می گردد.
مقدمه:
نقطهِ شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولكولی ، ضرورت جداسازیDNAبا كیفیت عالی است. معمولا كیفیتDNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی ازRNA، پروتئین، لیپید و سایرساختارهائی كه برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می كنند سنجیده می شود.(۱و۴) به علت بزرگ بودن اندازهِ DNA ژنومی در پستانداران، روشهای استخراج DNA باید حداقل استرس مكانیكی را در طی استخراج ایجاد نمایند. معمولإ روشهائی كه در آنها چندین شوینده همچونSDS وTritonX۱۰۰ استفاده می شود،كه نقش آنها لیز نمودن سلول و كمك به از بین بردن پروتئین متصل بهDNA می باشد. پروتئین زدائی بیشتر از طریق پروتیئنازK صورت می گیرد كه این ماده در بافر لیز كننده مورد استفاده قرار می گیرد(۴). این آنزیم در حضورSDS در دمایc ۵۶-۶۵فعالیت دارد تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشت می شود برعكس در همین شرایط آنزیمهای دیگر مثلDNAase دناتوره می شود. متعاقب استفاده از پروتیئنازK از ایزوپروپانول برای از بین بردن موِثر پروتئین ها استفاده می شود و باقیمانده پروتئین و لیپید نیز بطور موِثر از طریق كا ربرد فنل و كلروفورم از بین می رودآلودگیRNA از طریق تیمار كردن نمونه با RNAase از بین می رود. در روشهای دیگر بعد از پروتئینازK از نمك اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده می شود در استخراجDNA از هپارین برایPCR بهتر است استفاده نشود چون هپارین از فعالیتTaq پلی مراز جلوگیری می كند . وجودEDTA حداقلmM ۲در بافر استخراج باعث می شود كه كوانزیمهای آنزیمAase DN با EDTA شلات شود و از تجزیه تصادفیDNA جلوگیری نماید(۱و۴و۵)
. دستورالعمل استخراجDNA با پشتوانه ای از دانش بیوشیمی همراه است و نباید صرفا استفاده از چند ماده انگاشته شود، درك عملكرد هر ماده این امكان را فراهم خواهد نمود كه درصورت نبود یك ماده از ماده دیگری با كار مشابه استفاده كرد. در این تحقیق از روشهای استخراج DNA استفاده گردید كه در زیر به جزئیات آنها اشاره می شود.
مواد و روشها
نمونه های خون اسپرم ، شیر ، ریشه مو از گاوهای بومی وگاومیش جمع آوری گردید. خونگیری در گاوهای بزرگ از ورید دمی ودر گوساله ها از وریدوداج صورت گرفت. سپس نمونه ها از مزرعه داخل لوله های حاوی خلا و EDTA همراه با یخ به آزمایشگاه اصلاح نباتات مولكولی دانشگاه تبریز گردید و تا زمان استخراج در ۲۰ درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
تخلیص DNA
در این تحقیق، تخلیصDNA برروی اسپرم ، گلبولهای سفید خون ، شیر و ریشه مو انجام پذیرفت .
روش هاي استخراج DNA براي ژنوتايپينگ
روش جوشاندن
ابتدا ۵/۰ سی سی خون در تیوبهای ۵/۱ میلی لیتر كه فاقد هرگونه آلودگی می باشد ریخته و به میزان یك میلی لیتر بافر R(mM۱۰ تریس ۵/۷ =pH ،mM ۳۳/۰ ساكاروز ،mM ۱۰ كلرید منیزیم و۱% تریتون ۱۰۰X ) اضافه و خوب آن را مخلوط و به مدت دو دقیقه با سرعت g۱۰۰۰ سانتریفوژ می كنیم سپس محلول روئی دور ریخته و مراحل را آنقدر ادامه می دهیم تا رسوب سفید رنگ شود. سپس ۱۰۰ میكرولیتر محلول (mM ۵۰ هیدروكسید سدیم ) اضافه و به مدت ۲۰ دقیقه در آب حوش قرار داده می شود ، تا گلبولهای سفید لیز شوند بعد از آن ۲۰ میكرولیتر محلول (mM ۱بازتریس ۵/۷ = pH ) اضافه و بعد از سانتریفوژ كردن به مدت ۳۰ ثانیه در g۱۰۰۰ محلول روئی را در تیوب جدید منتقل وتا زمان انجام آزمایشها در ۲۰ – درجه سانتیگراد نگهداری می شود(۳).
تخلیص DNA به روش Salting out
ابتدا گلبولهای قرمز توسط بافر R لیز شده و گلبولهای سفید رسوب داده می شود. سپس ۳۰۰ میكرو لیتر بافر هضم كننده(mM ۱۰بازتریس، EDAT، mM۲۰، M۴۴/۰ كلرید سدیم) اضافه و سپس ۲۰ میكرولیترٍSDS (۱۰%) به تیوب اضافه می كنیم و بعد ۵ میكرولیتر پروتئینازK (۲۰ میلیگرم در میلی لیتر) به تیوب مربوطه اضافه می كنیم . تیوپ مربوط را در دمای ۵۵ درجه به مدت ۲ ساعت یا در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت یك شب قرار داده تا عمل هضم سلولی بخوبی صورت گیرد,۱۰۰ میكرولیتر محلولNaCl اضافه می كنیم و۱۰ الی۳۰ دقیقه در یخ یا فریزر۲۰ – قرار می دهیم. سپس سانتریفوژ با سرعت g۱۳۰۰۰ صورت می گیرد. جهت شستشوی رسوب مقدار اتانول ۷۰% به میزان ۵/۰ میلی لیتر اضافه گردیده و با دور g۱۳۰۰۰ در دمای ۴ درجه به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ صورت گرفت. بعد از خشك شدن رسوب DNA مقدار ۱۰۰ میكرولیتر TE (mM۱EDTA، ۸ pH ، mM۱۰ بازتریس ۶/۷ pH ) جهت حل شدن آن اضافه گردیده و سپس نمونه ها در۲۰ – درجه سانتیگراد به منظور بررسی مولكولی نگهداری می شود(۴) .
تخلیص DNA به روش تیوسولفات گوانیدین – سیلیكاژل
شیرحاوی انواع مختلفی از سلولها می باشد كه در مجموع سلولهای سوماتیك(Somatic Cell) نامیده می شود . در شیر به طور معمول سلولهای نوتروفیل، ماكروفاژ، لنفوسیت و ائوزینوفیل وسلولهای اپتلیال وجود دارد. به لحاظ وجود حساسیت شدید گاوهای بومی كشور و خوی نا آرام آنها كه همواره عملیات خونگیری را دچار مشكل كرده است ، دستیابی به DNA ژنومی از نمونه های شیر راه كم خطر و مناسبی به نظر می رسد,۱۰ میلی لیتر نمونه شیر در داخل لوله های آزمایش درب دار حاوی فرمالدئید جمع آوری گردید و برای استخراج سانتریفوژ g۱۰۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه صورت پذیرفت و محلول روئی دور ریخته شد. سپس رسوب باقی مانده با محلول سالین شستشو داده شد . بقیه مراحل طبق روش تیوسولفات گوانیدین- سیلیكاژل انجام پذیرفت. ۵۰۰ میكرولیتر بافر هضم كننده (M۵ تیوسیونالات گوانیدن،mM ۲۰EDTA،mM۴۰ Tris،۴۰ گرم ,TritonX۱۰۰۱۰ گرم DTT ) به نمونه شیر اضافه شده، نمونه ها به مدت ۵ دقیقه در بن ما ری حاوی ۶۵ درجه سانتیگرا د قرار گرفت. سپس ۲۰ میكرولیتر محلول نوكلئاز(۴ گرم ذرات سیلیكا،۱۰۰ میكرولیترگوانیدین) اضافه شد و به مدت ۱۰ دقیقه به آرامی ورتكس گردید. سپس به محیط همگن شده، ۴۰۰ میكرو لیتر بافرسالین EDTA ۲۰mM , Tris-HCl ۱۰mM , KCl ۱M , NaCl ۱M ) ) اضافه و در نهایت از طریق ماده Extra Gene (۱۰% رزین ۰۲/۰ % ماده رنگی OrangG،۰۱/۰ درصدTriton X ۱۰۰ ) ، DNA زرد رنگ از سایر ناخالصیها جدا گردید(۲) .
استخراج DNA از اسپرم و ریشه مو
استخراج DNA از پایتهای اسپرم با روشهای متداول ذكر شده امكان پذیر است، اما به جهت اینكه اسپرم مقدار زیادی كلسترول و نمك دارد، با استفاده از بافر ٍٍPBS، مقادیر كلسترول و نمك از رسوب شستشو می شود و سپس از روشهای ذكر شده می توان در ادامه استخراج استفاده نمود. در مورد ریشه مو قبل از استفاده از روشهای ذكر شده باید ریشه های مو با اتانل ۷۰ % چربی زدائی شوند. سپس در روی یك كاغذ صافی در ۶۵ درجه خشك شود. سپس ۵/۰ سانتیمتر از قسمتی كه حاوی ریشه های موی است با قیچی جدا می كنیم و در داخل تیوپ حاوی ۱۰۰ میكرولیتر بافرA (۲۰۰mM ، NaoH و DTT ۵۰ mM ) قرار می دهیم و ۱۵ دقیقه در دمای ۹۷ درجه سانتیگراد حرارت می دهیم و سپس سایر مراحل را طبق روشهای ذكر شده انجام می دهیم .
آغازگرها
برای موفقیت و دقیق بودن واكنش زنجیره پلی مراز ، آغاز گرها از ویژگی خاصی باید برخوردار باشند. آغازگرتصادفی مورد استفاده برای واكنش RAPD، OPU۱۳ خریراری شده از شركت Operon بود .و برای انجام تكنیك PCR-RFLP از پرایمرهای اختصاصی برای تكثیر بخشی از اینترون ژن لپتین استفاده شد. این دوجفت۲۴ mer بودند كه ناحیه ای از اینترون دو ژن لپتین گاوی را تكثیر می سازد ساخت پرایمرها دوم توسط شركت روسی SYNTOL صورت پذیرفت. توالی مورد تكثیردر ژن بانك(EMBL) با شماره Y۱۱۳۶۹,۱ موجود است.
واكنش زنجیره ای پلیمراز
مواد وغلظت مناسب برای ۲۵ میكرولیتر واكنش تهیه گردید. انجامPCR با استفاده از كیتGenepak PCR Universal صورت گرفت. از مزایای این كیت اینست كه آنزیم Taq DNA پلی مراز به كمك آنتی بادی مهار شده است وتنها در درجه حرارت بالا ( بالای ۹۰ درجه ) این آنتی بادی تخریب شده و آنزیم را رها می نماید لذا PCR به صورت Hot-Star انجام می گیرد. به تمام میكروتیوپها ۱۰ میكرولیترPCR Diluent اضافه می كنیم و میزان غلظت آغاز گرهای مورد استفاده ۲۰-۱۰ پیكومول می باشد واكنش زنجیره پلی مراز برای تكثیر ژن لپتین در ترموسایكر با برنامه (دناتوره شدن اولیه ۹۳ درجه سانتیگراد، به مدت ۲ دقیقه، دمای اتصال ۵۵ درجه به مدت یك دقیقه، دمای تكثیر ۷۲ درجه به مدت۱ دقیقه ، دمای دناتوره شدن ۹۳ درجه سانتیگراد، به مدت ۱ دقیقه، دمای تكثیر نهائی ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۳ دقیقه ) با ۳۳ سیكل انجام پذیرفت .برای واكنش PCR-RAPD ازبرنامه حرارتی، ۹۴ درجه به مدت ۲ دقیقه،۹۴ درجه به مدت ۳۰ ثانیه، ۴۵ درجه به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ درجه به مدرت ۳۰ ثانیه و بسط نهایی ۷۲ درجه به مدت ۱۰ دقیقه در ۴۵ سیكل استفاده گردید.
هضم آنزیمی
عمل هضم آنزیمی در حجم ۳۰ میكرولیتر با مصرف ۱۵ واحد آنزیمی تحت شرایط بافری و دمای مناسب با استفاده از آنزیم برشی Sau۳AI كه سایت برشی GATC را شناسایی می كند صورت پذیرفت
الكتروفوز محصولات PCR و هضم
ابتدا آگارز ۸/۱ % با بكار گیری بافرTBE ۱ ، ./۰۹mM تریس ، ./۰۹mM اسید بوریك و EDTA./۰۲mM ) تهیه و به ازای هر۱۰ میلی لیتر ژل ۲/۰ میكرو لیتر اتیدیوم بروماید (۱۰mg/ml) به آن اضافه كرده و در ظرف مخصوص حاوی شانه ریخته می شود.بعد از بسته شدن ژل، به ازای ۷ میكرولیتر محصول PCR با دومیكرولیتر لودینگ بافر( بروموفنل بلو ۲۵/۰ درصد، ساكارز۴۰ % ) مخلوط نموده سپس در چاهكهای ژل قرار داده می شوند . با ولتاژ بالا حدود ۱۰۰ ولت شروع تا اینكه نمونه ها از چاهك خارج شود سپس ولتاژ را به حدود ۷۰ ولت رسانیده و سپس از یكساعت الكتروفورز نمونه ها با استفاده از دستگاه نور ماورا بنفش مورد بررسی قرار می گیرند
بحث:
نتایج نشان داد كه كیفیت و كمیت DNA حاصله و روش سیلیكا ژل و Salting out بهتر ومطلوبتر از روش جوشاندن است و از نظرفیزیكی نیزكمتر باعث فرسودگی DNA میشود. روش جوشاندن باعث ایجاد DNA بصورت اسمیر و حاوی پروتئین زیاد می شود غلظت DNA حاصله در روش جوشاندن ۱۴۰-۱۹۰mg/ml و در روش Salting out و سیلكاژل ۴۰۰μg/ml محاسبه شد.
یك قطعه bp ۴۲۲ از ژن لپتین كه شامل اینترون می شد توسط PCR تكثیرگردید و برای هضم آنزیمی از sau۳AI استفاده شد.روش گوانیدین –تیوسولفات روش مناسبی است كه در آن ذارت سیلیكون به جای فنل و پرو پانل در رسوب دادنDNA از مخلوط لیز سلولها می باشد. در این روش در حضورغلظت بالای نمك سیلیكا به رشته های DNA چسبیده و آنها را رسوب می دهند و در حضور غلظتهای پایین نمك آن را رها می كنند و بنابراین از این خاصیت می توان به جای رسوب دادن اتانل یا ایزوپروپانل از این ذرات استفاده كرد. از مزایای دیگر این كیت اینست كه در مرحله نهایی DNA در فاز زرد رنگ قرار می گیرد و در نتیجه به آسانی قابل جا شدن از سایر ناخالصیهای نامطلوب می باشد. از این روش می توان از خون كهنه و یا حتی لخته شده نیز برای استخراج استفاده كرد.
Refernce:
۱.Berthomieu P and Meyer C (۱۹۹۱) Direct amplification of plant genomic DNA from leaf and root pieces using PCR. Plant Mol Biol ۱۷: ۵۵۵–۵۵۷.
۲.Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Wertheim-Van Dillen, P.M.E. & Van Der Noordaa, J. ۱۹۸۹. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology., ۲۸(۳) : ۴۹۵-۵۰۳.
۳.Chikuni, K., Y. Fukumoto, R. Tanabe and S. Muroya S,۱۹۹۷. Simple method for genotyping the bovine growth hormon gene. Animal Genetic ۲۸: ۲۳۰-۲۳۲
۴.Jeanpierre, M,۱۹۸۷. A rapid method for the purification of DNA from blood. Nucleic Acid. Research. ۱۵(۲۲): ۹۶۱۱.
۵.Merante, F., S. Raha and M. Ling. Isolation of total cellular DNA from tissue and cultured cells. In: Rapley, R. and J. M. Walker,۱۹۹۹. Molecular Biomethods Handbook. Humana press Inc, Totowa.
۶.Reymond, C. D. ۱۹۸۷. A. rapid for the preparation of multiple samples of ucaryotic DNA. Nucleic Acid.PP۲۳۸
۷.Tomas HT and Tanksley SD (۱۹۸۹) A rapid and inexpensive method for isolation of total DNA from dehydrated plant tissue. Plant Mol Biol Rep ۱۲: ۱۰۶–۱۰۹.
آرش جوانمرد، محمد رضا نصیری و قربان الیاسی زرین قبائی
