محیط کشت آگار خوندار Blood agar
محیط کشت عمومی است که به منظور تکثیر و جدا سازی باکتریهای بیماریزا بخصوص باکتریهایی که برای رشد به مواد مغذی نیاز دارند، بکار می رود.بعلاوه در این محیط وجود همولیزین در باکتریها را نیز می توان کاوش کرد.
پس از اتوکلاو محیط پایه هنگامی که درجه آن تا حدود ۵۰ درجه سانتیگرا د رسید، خون دفیبرینه گاو را به نسبت ۵ تا ۷ درصد به آن اضافه نموده و با رعایت شرایط استریل در پلیتهای استریل می ریزیم.
ممکن است بسته به نوع باکتری یکی از سه حالت ذیل مشاهده گردد.
۱-همولیز کاملβ:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده واطراف پرگنه منطقه شفافی ایجاد میگردد.
۲- همولیز ناقصα:باکتری واجد آنزیم همولیزین بوده ولی نسبت لیز کمتر از ۵۰ درصد می باشد و اطراف پرگنه هاله سبز رنگ ایجاد می گردد.
۳-عدم همولیزγ :باکتری فاقد آنزیم همولیزین می باشد
محیط کشت مک کانکی آگار Macconkey agar
محیط انتخابی است که برای جداسازی و تعیین هویت باکتریهای گرم منفی می باشد. املاح صفراوی و کریستال ویوله مانع از رشد باکتریهای گرم مثبت می شوند. باکتریهای تخمیر کننده ی لاکتوز (لاکتوز مثبتها) کلنیهایی به رنگ ارغوانی و باکتریهاییی که قادر به تخمیر نیستند (لاکتوز منفیها )کلنیهایی بی رنگ ایجاد می نمایند.
رنگ ارغوانی کلنیهای باکتریهای لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است.
معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی رنگ و در محیط اسیدی قرمز رنگ است.
محیط کشت MRVP
این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرمها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن از این محیط استفاده می شود.
آزمایش MR: پس از انجام کشت و انکوباسیون ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت ، مقدار ۶/۰ میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.
نتیجه: ظهور رنگ قرمز———آزمایش مثبت (PH=۴/۴)
ظهور رنگ نارنجی——-آزمایش مثبت ضعیف(PH=۵/۳)
ظهور رنگ زرد ———آزمایش منفی (PH=۵/۳)
آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود۶/۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس (معرف B) اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آنرا به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت ،واگر تغییر رنگی صورت نپذیرد ، آزمایش VP منفی خواهد بود.
نتیجه: مثبت= ظهور رنگ صورتی تا قرمزمنفی= تغییر رنگی صورت نمی گیرد.محیط کشت سلنیت F براث Selenite F broth
محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها .که یک محیط غنی کننده Enrichment می باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی میگردد.میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی ۲۴-۱۲ ساعت اول از رشد هر یک از باکتریهای روده ای سریعتر است .بنابر این کشت ثانوی باکتری در محیطهای دیگر باید ظرف همان روز (۲۴-۱۲ ساعت) انجام گردد.
باید توجه داشت این محیط در صورت ماندن و کهنه شدن خراب شده و رنگ آن به صورتی می گراید. بنابر این هرچه کم رنگتر باشد ، تازه تر و برای کشت مناسبتر خواهد بود.
محیط کشت SIM ((Sulfide-Indol-Motility
با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز در این محیط کشت می دهیم.
اساس آزمایش:مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است.قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.
ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و درصورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است ،انتشار می یابد .سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد.با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است .باکتریهای که حاوی مجموعه آنزیمهایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند ،باشند قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.
حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد.باکتریهای فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است،کدر می کنند.برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.
محیط کشت SS Salmonella Shigella agar
یک محیط انتخابی است که جهت تشخیص سالمونلا و شیگلا مورد استفاده قرار می گیرد. این محیط حاوی تیو سولفات سدیم بعنوان منبع گوگرد و آهن فریک بعنوان منبع آهن می باشد. وهمچنین حاوی لاکتوز و معرف نوترال رد می باشد .اگر باکتری تیوسولفات محیط را احیا کند، H۲S تولید نموده که H۲S با آهن موجود در محیط تولید پرگنه های سیاه رنگ می نماید . اکثر باکتری های لاکتوز مانند سالمونلا ها H۲S مثبت میباشند.
محیط کشت سیمون سیترات آگار Simmons Citrate agar
برای تعیین قدرت باکتری در استفاده از سیترات به عنوان تنها عامل کربندار موجود در محیط میباشد. باکتریهایی که قادر به رشد در این محیط باشند در حقیقت توانسته اند از سیترات که تنها عامل کربن دار در محیط است استفاده کنند و در نتیجه در مجاورت معرف رنگی بروموتیمول بلو به رنگ آبی در می آیند.در غیر این صورت به علت عدم رشد باکتری و عدم تغییر رنگ محیط آزمایش سیترات منفی است.
محیط کشت سه قندی آهن دار ( TSI) Triple Sugar iron agar
از این محیط جهت تعیین هویت باکتریهای گرم منفی استفاده می شود. همچنین برای تعیین تولید H۲S بکار می رود.این محیط دارای سه قند گلوکز-سوکروز و لاکتوز می باشد مقدار کمتر گلوکز در قیاس با دو قند دیگر تمایز باکتریها را در تخمیر قندهای مختلف ممکن می سازد. آهن موجود در محیط گاز هیدروژن سولفوره ای را که از مواد گوگرد دار تولید می شود را به دام انداخته و مانع از خروج این گاز از محیط می شود .این واکنش به صورت رنگ سیاه که همان سولفور آهن است مشخص می گردد.گازی که در نتیجه تخمیرمواد قندی حاصل می شود به صورت حبابهایی در عمق محیط دیده می شوند،ویا اینکه حجم گاز ممکن است زیاد بوده که در این صورت محیط آگار را به سمت بالای لوله رانده و فضای زیادی را اشغال می سازد.
نتایج TSI:
۱-در صورتی که هر دو قسمت شیب دار و ته لوله زرد شده و حباب تشکیل گشته ولی سیاه نشده باشد.یعنی گلوکز ،لاکتوز و سوکروز را تخمیر نموده و اسد تولید کرده و همچنین گاز نیز تولید نموده ولی H۲S تولید نشده است acid/acid ، Gaz+ ،- H۲S می باشد.
۲- در صورتی که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و گاز تولید و سیاه باشد ،یعنی تنها قند گلوکز تخمیر شده و H۲S نیز تولید شده است. Acid Alk/ ، Gaz+ ،+H۲S می باشد.
۳- در صورتی که ته لوله زرد و شیب لوله ارغوانی و تولید و سیاه شده باشد، یعنی اینکه تنها گلوکز را تخمیرنموده و H۲S تولید نشده است . Alk/Acid ، Gaz- ،- H۲S می باشد.
۴- در صورتی که ته لوله و شیب لوله هر دو زرد و گاز متغیر باشد و ته لوله لوله نیز سیاه شده باشد، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و H۲S نیز تولید نکرده است. acid/acid ، Gaz متغیر ،+ H۲S می باشد.
۵- در صورتی که سرتاسر لوله ارغوانی و سیاه نشده باشد، یعنی اینکه هیچ یک از قندها را تخمیر ننموده و H۲S نیز تولید نکرده است. Alk/Alk ، Gaz- ،- H۲S می باشد
۶- در صورتی که سرتا سر لوله زرد و گاز و سیاهی در ته لوله متغیر باشد ، یعنی اینکه هر سه قند را تخمیر نموده و تنها اسید تولید کرده ، گاز و H۲S تولید ننموده است. acid/acid ، Gaz- ،- H۲S می باشد.
نکته : باید توجه داشت که نتایج کشت حداکثر طی ۲۴ ساعت پس از کشت قرائت گردد،چه بسا پس از این مدت ممکن است واکنشهای اسیدی قسمت شیبدار تغییر یافته و قلیایی گردد.قسمتی از این تغییر واکنش اسیدی به قلیایی مربوط به این است که ذخیره کربوهیدرات های موجود در محیط تماما مصرف شده که در این صورت باکتری به مواد پپتون دار محیط رو می آورد و همچنین مقدار ناچیز اسیدی که در اثر تخمیر گلوکز حاصل شده به سرعت در مجاورت هوا (قسمت شیبدار ) اکسید شده و ما حصل قلیایی است.در عمق لوله نیز به سبب فشار کم اکسیژن واکنش اسیدی حاصل از تخمیر قند گلوکز و همچنان اسیدی باقی می ماند.
